Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

Summary

Este protocolo demonstra um modelo único de acidente vascular cerebral em camundongo com um infarto de tamanho médio e uma excelente taxa de sobrevida. Esse modelo permite que os pesquisadores pré-clínicos do AVC estendam a duração da isquemia, usem camundongos envelhecidos e avaliem os resultados funcionais a longo prazo.

Abstract

Na pesquisa experimental de AVC, a oclusão da artéria cerebral média (ACM) com um filamento intraluminal é amplamente utilizada para modelar o acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos. O modelo de MCAO filamentar tipicamente exibe um infarto cerebral maciço em camundongos C57Bl/6 que às vezes inclui tecido cerebral no território suprido pela artéria cerebral posterior, o que é em grande parte devido a uma alta incidência de atresia da artéria comunicante posterior. Este fenômeno é considerado um dos principais contribuintes para a alta taxa de mortalidade observada em camundongos C57Bl/6 durante a recuperação de AVC a longo prazo após MCAO filamentar. Assim, muitos estudos de AVC crônico exploram modelos de MCAO distais. No entanto, esses modelos geralmente produzem infarto apenas na área do córtex e, consequentemente, a avaliação de déficits neurológicos pós-AVC poderia ser um desafio. Este estudo estabeleceu um modelo de MCAO transcraniana modificada no qual a MCA no tronco é parcialmente ocluída permanente ou transitoriamente através de uma pequena janela craniana. Como o local de oclusão é relativamente próximo à origem da ACM, esse modelo gera dano cerebral tanto no córtex quanto no estriado. A extensa caracterização deste modelo demonstrou uma excelente taxa de sobrevida a longo prazo, mesmo em camundongos envelhecidos, bem como déficits neurológicos prontamente detectáveis. Portanto, o modelo de camundongo MCAO descrito aqui representa uma ferramenta valiosa para a pesquisa experimental de AVC.

Introduction

Quase 800.000 pessoas sofrem um acidente vascular cerebral nos EUA a cada ano, e a maioria desses acidentes vasculares cerebrais é de natureza isquêmica¹. A restauração oportuna do fluxo sanguíneo cerebral com ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e/ou trombectomia é atualmente o tratamento mais eficaz para pacientes com AVC; entretanto, a recuperação completa das funções neurológicas em longo prazo é rara ^2,3. Assim, a busca por novas terapias para AVC que visem a melhora funcional é uma área intensa de pesquisa que requer modelos animais clinicamente relevantes de AVC.

O modelo de AVC isquêmico mais comum em roedores utiliza a oclusão intraluminal da artéria cerebral média (ACM) para induzir acidente vascular cerebral. Nesse modelo, desenvolvido inicialmente por Zea Longa em 1989, um filamento de náilon é introduzido na artéria carótida interna (ACI) para bloquear o fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média (ACM)⁴. No entanto, esse modelo apresenta limitações. Primeiro, quando o filamento é inserido na ACI, o fluxo sanguíneo para a artéria cerebral posterior (ACP) também pode ser parcialmente bloqueado, especialmente em camundongos. Criticamente, a artéria comunicante posterior (PcomA), uma pequena artéria que conecta a circulação cerebral anterior e posterior, é frequentemente subdesenvolvida em algumas cepas de camundongos, como a C57Bl/6, a cepa predominantemente usada em pesquisas experimentais de AVC. Acredita-se que essa patência do PComA contribua para a variabilidade no tamanho da lesão em camundongos após^AVE5. De fato, quando o fluxo sanguíneo para a ACP cai vertiginosamente durante a ACM, e a PcomA é incapaz de fornecer fluxo sanguíneo colateral suficiente, o infarto do AVC pode se expandir para o território da ACP. Além disso, nesse modelo, uma longa duração de isquemia leva a uma maior chance de mortalidade em camundongos. Consequentemente, uma curta duração MCAO de 30-60 min é tipicamente usada em camundongos. No entanto, a maioria dos pacientes com AVC experimenta algumas horas de isquemia antes do tratamento de reperfusão. Assim, um modelo de AVC em camundongo com duração prolongada de isquemia é de alta relevância clínica.

O objetivo geral deste procedimento é modelar o acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos com infarto de tamanho médio e excelente taxa de sobrevida. Este modelo transcraniano de MCAO aborda atributos críticos do AVC clínico, uma vez que isquemia prolongada pode ser realizada, e camundongos idosos toleram bem esse modelo, permitindo a avaliação em longo prazo da recuperação funcional.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste trabalho são conduzidos de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais em pesquisa, e o protocolo foi aprovado pelo Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Camundongos C57Bl/6 machos jovens (8-10 semanas de idade) e com idade (22 meses) foram utilizados para o presente estudo. Uma visão geral desse protocolo é ilustrada na Figura 1. 1. Preparo cirúrgico Examine …

Representative Results

Com uma visão direta sob um microscópio cirúrgico, pode-se confirmar visualmente que o fluxo sanguíneo da ACM está bloqueado durante a isquemia. Nosso estudo prévio demonstrou redução de >80% do fluxo sanguíneo na área isquêmica com o uso do monitor laserDoppler6. Para determinar as alterações do fluxo sanguíneo pós-MCAO, o LSCI pode ser usado para confirmar ainda mais o insulto isquêmico e a reperfusão (Figura 1). De fato, na Fig…

Discussion

O primeiro modelo de oclusão transcraniana da ACM foi estabelecido em ratos em 1981 ^11,12 e substituído pelo modelo de MCAO sem craniectomia em^{1989 4}. A oclusão transcraniana inicial da ACM tinha um campo cirúrgico amplo, de modo que todo o arco zigomático foi removido e os músculos tracionados lateralmente. Os tecidos locais ficaram inchados após a cirurgia, causando estresse e diminuição da ingestão alimentar dos animais. Em no…

Materials

0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chloride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma or any available vendor
20 G IV catheter	BD	381534	20 GA 1.6 IN
30 G needle	BD	305106
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
8-0 suture with needle	Ethilon	2822G
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia induction box	Any suitable vendor		Pexiglass make
Electrical grinder	JSDA	JD 700
High temperature cautery loop tip	Bovie	AA03
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Nitrous Oxide	Airgas	UN1070
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
Povidone-iodine	CVS	955338
Recovery box	Brinsea	TLC eco
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/mL
Rodent ventilator	Harvard	Model 683
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S