Summary

In vitro Cartographie chimique des structures de l’ADN G-quadruplex par Bis-3-chloropipéridines

Published: May 12, 2023
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Summary

Les bis-3-chloropipéridines (B-CePs) sont des sondes chimiques utiles pour identifier et caractériser les structures G-quadruplex dans les matrices d’ADN in vitro. Ce protocole détaille la procédure permettant d’effectuer des réactions de sondage avec des B-CeP et de résoudre les produits de réaction par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à haute résolution.

Abstract

Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures d’ADN biologiquement pertinentes, non canoniques, qui jouent un rôle important dans l’expression des gènes et les maladies, représentant des cibles thérapeutiques importantes. Des méthodes accessibles sont nécessaires pour la caractérisation in vitro de l’ADN dans les séquences potentielles de formation de G-quadruplex (PQS). Les B-CeP sont une classe d’agents alkylants qui se sont avérés être des sondes chimiques utiles pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des acides nucléiques. Cet article décrit un nouveau test de cartographie chimique exploitant la réactivité spécifique des B-CeP avec le N7 des guanines, suivi d’un clivage direct des brins au niveau des G alkylés.

En effet, pour distinguer les plis G4 des formes d’ADN dépliées, nous utilisons B-CeP 1 pour sonder l’aptamère de liaison à la thrombine (TBA), un ADN de 15 mères capable d’assumer l’arrangement G4. La réaction des guanines répondant au B-CeP avec le B-CeP 1 permet d’obtenir des produits qui peuvent être résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à haute résolution au niveau d’un seul nucléotide en localisant les adduits d’alkylation individuels et le clivage des brins d’ADN au niveau des guanines alkylées. La cartographie à l’aide de B-CePs est un outil simple et puissant pour la caractérisation in vitro de séquences d’ADN formant G-quadruplex, permettant la localisation précise des guanines impliquées dans la formation des G-tétrades.

Introduction

En plus de la double hélice typique de Watson-Crick, les acides nucléiques peuvent adopter diverses structures secondaires, telles que la forme alternative G-quadruplex (G4), en raison de leurs séquences riches en guanine. La structure G4 est basée sur la formation de tétramères planaires, appelés G-tétrades, dans lesquels quatre guanines interagissent par l’intermédiaire de liaisons hydrogène Hoogsteen. Les G-tétrades sont empilées et stabilisées par des cations monovalents qui sont coordonnés au centre du noyau de guanine (Figure 1)1.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique d’une structure G-quadruplex. (A) Représentation schématique d’une tétrade G. Le réseau planaire est stabilisé par l’appariement de bases de Hoogsteen et par un cation central (M+). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les séquences comportant quatre cycles ou plus d’au moins deux nucléotides consécutifs de guanine sont des séquences potentielles formant des G-quadruplex (PQS) qui peuvent se replier dans des structures G-quadruplex. Les PQS sont situés dans de nombreux contextes cellulaires différents, tels que les télomères, les promoteurs de gènes, l’ADN ribosomique et les sites de recombinaison, et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques2. Par conséquent, l’identification et la validation expérimentale des G4 dans le génome humain, qui sont actuellement effectuées principalement à l’aide d’outils informatiques, est une question biologiquement pertinente3. Afin de soutenir les prédictions computationnelles ou de détecter des structures G4 non prédites, une méthode accessible basée sur la cartographie chimique pour identifier la formation de G4 dans une matrice d’ADN est présentée ici, permettant l’identification précise des guanines formant la structure G-tétrade.

Le test de cartographie chimique rapporté exploite la réactivité différente des bis-3-chloropipéridines (B-CePs) avec les guanines suite à la formation de structures G4. En raison de leur forte réactivité avec les nucléophiles 4,5,6,7,8,9, les B-CeP sont des agents alkylants d’acides nucléiques ayant la capacité de réagir très efficacement avec la position N 7 des nucléotides de guanine10. L’alkylation est suivie de la dépurination et du clivage des brins dans les constructions d’ADN simple et double brin. Au contraire, les guanines impliquées dans la formation des G-tétrades dans les arrangements G4 sont imperméables à l’alkylation B-CeP, car la position N7 des guanines est impliquée dans les liaisons hydrogène de Hoogsteen. Cette réactivité spécifique des B-CePs permet non seulement la détection des structures G4, mais aussi l’identification des guanines formant la ou les tétrades, telles qu’elles peuvent être déduites de leur protection relative contre l’alkylation par rapport aux guanines dans l’ADN simple et double brin.

Le protocole de cartographie chimique est présenté ici en utilisant B-CeP 1 (Figure 2A) comme sonde pour la caractérisation de l’aptamère de liaison à la thrombine (TBA), un ADN de 15 mères capable d’assumer l’arrangement G4 en présence de cations potassiques11,12. L’arrangement G4 de TBA (G4-TBA) est directement comparé à deux témoins, à savoir TBA sous la forme simple brin (ssTBA) et TBA recuit à sa séquence complémentaire pour former la construction double brin (dsTBA) (tableau 1). Les produits des réactions de sondage sont résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à haute résolution (PAGE) au niveau du mononucléotide en localisant les adduits d’alkylation individuels et le clivage des brins d’ADN au niveau des guanines alkylées. La visualisation sur le gel est rendue possible par la conjugaison de l’oligonucléotide TBA avec un fluorophore à son extrémité 3′ (Tableau 1). Ce protocole montre comment plier TBA dans ses différentes conformations (G4 et témoins), et comment effectuer des réactions de sondage avec des B-CeP suivis de PAGE.

Protocol

1. Préparation de la sonde d’acide nucléique et chimique Acides nucléiquesREMARQUE : L’oligonucléotide nommé « TBA » est la séquence d’ADN 5′-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-TGG-3′ de 15 mères marquée à l’extrémité 3′ par le fluorophore 5-carboxyfluorescéine (FAM) pour permettre la visualisation sur le gel. L’oligonucléotide non marqué « cTBA » est sa séquence complémentaire d’ADN 5′-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3′. TBA et cTBA sont utilisés pour obtenir les trois structures dif…

Representative Results

La figure 2 montre un résultat représentatif d’un test de cartographie chimique effectué, tel que décrit dans le protocole avec B-CeP 1 sur l’oligonucléotide TBA replié dans trois structures différentes. L’arrangement G-quadruplex de TBA (G4-TBA) a été obtenu en repliant l’oligonucléotide dans le BPE et en présence du cation K+, tandis que la forme simple brin de la même séquence TBA (ssTBA) a été repliée en l’absence de potassium. La construction double …

Discussion

Les G-quadruplexes sont des structures secondaires d’acides nucléiques qui se replient généralement dans des séquences d’ADN riches en guanine et sont des cibles de recherche importantes en raison de leur association avec le contrôle génétique et les maladies. La cartographie chimique par B-CePs est un protocole utile pour la caractérisation des G4 de l’ADN, qui peut être utilisé pour identifier les bases de guanine impliquées dans la formation des G-tétrades dans des conditions physiologiques de sel.</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Département des Sciences Pharmaceutiques et Pharmacologiques de l’Université de Padoue (PRIDJ-BIRD2019).

Materials

Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

References

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Cite This Article
Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

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