Summary
Deze studie presenteert een methode om de morfologie van mitochondriën te analyseren op basis van immunokleuring en beeldanalyse in hersenweefsel van muizen in situ. Het beschrijft ook hoe dit het mogelijk maakt om veranderingen in de mitochondriale morfologie te detecteren die worden veroorzaakt door eiwitaggregatie in modellen voor de ziekte van Parkinson.
Abstract
Mitochondriën spelen een centrale rol in het energiemetabolisme van cellen en hun functie is vooral belangrijk voor neuronen vanwege hun hoge energiebehoefte. Daarom is mitochondriale disfunctie een pathologisch kenmerk van verschillende neurologische aandoeningen, waaronder de ziekte van Parkinson. De vorm en organisatie van het mitochondriale netwerk is zeer plastisch, waardoor de cel kan reageren op omgevingssignalen en -behoeften, en de structuur van mitochondriën is ook nauw verbonden met hun gezondheid. Hier presenteren we een protocol om mitochondriale morfologie in situ te bestuderen op basis van immunokleuring van het mitochondriale eiwit VDAC1 en daaropvolgende beeldanalyse. Deze tool zou met name nuttig kunnen zijn voor de studie van neurodegeneratieve aandoeningen, omdat het subtiele verschillen in mitochondriale tellingen en vorm kan detecteren die worden geïnduceerd door aggregaten van α-synucleïne, een aggregatiegevoelig eiwit dat sterk betrokken is bij de pathologie van de ziekte van Parkinson. Deze methode maakt het mogelijk om te rapporteren dat substantia nigra pars compacta dopaminerge neuronen met pS129-laesies mitochondriale fragmentatie vertonen (zoals gesuggereerd door hun verminderde beeldverhouding, AR) in vergelijking met hun gezonde naburige neuronen in een voorgevormd fibril intracranieel injectie Parkinson-model.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel heeft een intense vraag naar ATP: neuronen gebruiken ATP om ionische gradiënten, neurotransmittersynthese, mobilisatie, afgifte en recycling van synaptische blaasjes te ondersteunen, en om lokale eiwittranslatie en -afbraak mogelijk te maken. Meer dan 95% van het ATP dat door de hersenen wordt gebruikt, wordt geproduceerd door de mitochondriën1. Daarom is het niet verwonderlijk dat mitochondriale disfunctie bijzonder schadelijk is voor neuronen. In feite spelen mitochondriale functiestoornissen een belangrijke rol bij verschillende neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson (PD) en de ziekte van Alzheimer (AD)2,3.
Meerdere genen zijn ondubbelzinnig gekoppeld aan PD-coderende eiwitten die relevant zijn voor mitochondriale functie en homeostase, zoals Parkin 4,5,6, PTEN-geïnduceerd kinase 1 (PINK1)7,8 en DJ-19. Verder bewijs voor een rol voor mitochondriale disfunctie bij PD is dat behandelingen met remmers van Complex I van de mitochondriale elektronentransportketen (zoals Rotenon en MPTP) verschillende aspecten van PD in vitro en in vivo recapituleren 10. Het is echter belangrijk om te vermelden dat veel pathologische processen neuronaal verlies bij PD kunnen veroorzaken, samen met mitochondriale tekorten: oxidatieve stress, veranderde calciumhomeostase, falen van het ubiquitine-proteasoom en van autofagie-lysosomale systemen, en eiwitaggregatie behoren tot de meest bestudeerde (beoordeeld in 11,12,13 en).
Mitochondriën zijn heterogeen van vorm: naast individuele eenheden worden ze vaak aangetroffen als uitgebreide reticulaire en buisvormige netwerken. De structuur en de cellulaire locatie van mitochondriën zijn van cruciaal belang voor hun functie14; In feite zijn mitochondriale netwerken extreem dynamisch en ondergaan ze frequente processen van splijting, fusie en mitofagie om aan de behoeften van de cellen te voldoen en te reageren op omgevingssignalen15,16. Bovendien is de morfologie van mitochondriën nauw verbonden met hun gezondheidstoestand. Bij menselijke optische atrofie leiden genetische mutaties die de mitochondriale activiteit verminderen bijvoorbeeld tot abnormale, slanke en hypergefuseerde mitochondriën17. Aan de andere kant vertonen verschillende ziekten bij de mens een afwijkende mitochondriale morfologie, waaronder mitochondriale fragmentatie of overmatige mitochondriale fusie, die schadelijke effecten hebben op de mitochondriale functie (besproken in18). In de context van PD hebben wij en anderen eerder aangetoond dat abnormale mitochondriale vorm correleert met disfunctie als reactie op α-synucleïne-aggregaten19. Hoewel de mitochondriale morfologie uitgebreid in vitro is bestudeerd, zowel in de context van PD als andere ziekten, ontbreken protocollen voor de evaluatie van mitochondriale morfologie van in vivo secties. Dit maakt de in vivo studie van mitochondriën in de context van ziekten zoals PD sterk afhankelijk van transgene dieren23 of de evaluatie van extracten van de middenhersenen die geen cellulaire resolutie kunnen bieden.
Hier wordt een protocol gepresenteerd om de mitochondriale morfologie in situ te bestuderen als een indicator van hun functionele status en gezondheid, gebaseerd op immunokleuring van het mitochondriale eiwit VDAC124 gevolgd door beeldanalyse in in paraffine ingebedde weefselsecties. We tonen de resultaten van dit protocol ook in in vitro en in vivo PD-modellen: neuroblastoomcellen die SNCA (Synucleïne Alfa) tot overexpressie brengen en hersenweefsel van muizen die intracraniële injectie van α-synucleïne voorgevormde fibrillen (PFF's) ondergingen. Co-immunokleuring met een antilichaam tegen α-synucleïne (in cellen) of fosfoSer129-α-synucleïne pS129 (in muizenhersenen) stelde ons in staat om cellen te identificeren met geaggregeerde eiwitpathologie (respectievelijk α-synucleïne en α-synucleïnefibrillen) in de monsters, terwijl negatieve cellen dienden als een niet-pathologische controle binnen dezelfde monsters. Door deze analyse en de hier beschreven gegevens werd een verminderde beeldverhouding waargenomen, wat wijst op de fragmentatie van mitochondriën in cellen die SNCA tot overexpressie brengen of pS129-laesies vertonen.
Protocol
Alle procedures die in deze sectie worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met het ethische kader van de Universiteit van Baskenland Referentie M20/2022/212, de regering van Baskenland, de Spaanse regering en de Europese Unie.
1. Mitochondriale morfologieanalyse in SNCA-overexpressie SH-SY5Y-cellen
OPMERKING: Hier wordt een korte beschrijving gegeven van de generatie van het in-vitromateriaal voor het onderzoek, dat zal dienen als vergelijking voor de in situ verkregen resultaten. Het wordt aanbevolen om dit type analyse uit te voeren voordat een in vivo experiment voor mitochondriale morfologie wordt gestart, omdat het ervoor zorgt dat alle geschikte beeldvormings- en analyse-opstellingen aanwezig zijn.
- Om de cellulaire hechting te vergroten en de cellulaire hechting op vlakke optische bodemplaten met 96 putjes te vergemakkelijken, voegt u 25 μL/putje coatingmatrix 1:1000 toe in DMEM F12 door te pipetteren (zie Materiaaltabel). Incubeer de platen gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Tel SH-SY5Y met behulp van de Neubauer-kamer. Verwijder de coatingmatrix door te pipetteren en zaai 10.000 cellen/putje op de gecoate plaat met 96 putjes in 50 μL/putje DMEM F-12 aangevuld met 10% FBS, 2 mM glutamine en penicilline/streptomycine (zie materiaaltabel).
- Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2gedurende 24 uur.
- Bereid een mengsel van 250 ng pcDNA3.1 met humane wildtype SNCA, 0,250 μl van het transfectiereagens, 0,250 l transfectieadjuvans en transfectiemedium tot 50 μl voor elk putje (zie materiaaltabel). Bereid een hoofdoplossing voor, rekening houdend met het totale aantal putten in het experiment.
- Verwijder het kweekmedium door handmatig te pipetteren en voeg 50 μl/putje van de in stap 1.4 bereide oplossing toe door te pipetteren. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2.
- h verwijder na transfectie het transfectiemedium door te pipetteren en voeg 25 μL/putje 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan PBS.
LET OP: Paraformaldehyde is een giftig fixeermiddel; gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (R.T). Verwijder de fixeeroplossing door te pipetteren en was eenmaal door 50 μL/putje PBS toe te voegen. Verwijder PBS door te pipetteren.
- Pipetteer 25 μL/putje TBS met 0,05% Tween (TBS-T) en 10% normaal ezelserum (NDS, zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 1 uur bij RT om elk niet-specifiek signaal te blokkeren.
- Bereid een oplossing van konijn-anti-α-synucleïne-antilichaam MJFR1 1:1000 samen met muis-anti-TOMM20-antilichaam 1:100 in TBS-T (zie materiaaltabel) volgens het aantal te analyseren putjes.
- Verwijder de blokkerende oplossing uit stap 1.8 door te pipetteren en voeg 25 μl/putje toe van het mengsel van primaire antilichamen dat in stap 1.9 is bereid. Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was driemaal door 50 μL/putje TBS-T toe te voegen en te verwijderen door te pipetteren.
- Bereid een oplossing van groen secundair antilichaam anti-muis 1:1000 samen met rood secundair antilichaam anti-Konijn 1:1000 in TBS-T (zie materiaaltabel) volgens het aantal te analyseren putjes.
- Na het opzuigen van de PBS van de laatste wasbeurt beschreven in stap 1.11, voegt u 25 μL/putje van het secundaire antilichaammengsel toe met behulp van een pipet en incubeert u de plaat gedurende 1 uur bij RT.
- Verwijder de secundaire antilichaamoplossing door te pipetteren en voeg 25 μl/putje DAPI van 2 g/ml toe in TBS-T. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij R.T.
- Verwijder de DAPI-oplossing met behulp van een pipet en was driemaal door 50 μL/putje TBS-T toe te voegen en te verwijderen met een pipet.
- Pipetteer 80 μl/putje PBS met 0,02% natriumazide en bewaar de plaat bij 4 °C.
LET OP: Natriumazide is giftig; gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Leg beelden vast met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop met een hoog gehalte of een gelijkwaardig confocaal beeldvormingssysteem dat is uitgerust met een 60x-objectief (zie Tabel met materialen).
- Voer een analyse uit van het TOMM20-signaal van afzonderlijke cellen met behulp van Fiji volgens de stappen 3.15-3.21. Vermijd cellen die apoptose, necrose of mitose ondergaan.
OPMERKING: Om dit te doen, sluiten we de cellen uit van de analyse die de morfologische kenmerken van apoptose, necrose of mitose vertonen die zichtbaar zijn onder de microscoop, zoals celkrimp, membraanblebbing, celloslating, nucleaire condensatie, DNA-fragmentatie en gecondenseerd nucleair chromatine georganiseerd in dikke strengen die in een enkel vlak zijn uitgelijnd.
2. Het genereren van PFF's en PFF intracraniële injecties bij muizen
OPMERKING: Het genereren van injectiemateriaal en het intracraniële injectieproces worden hier gepresenteerd. Dit protocol is overgenomen van Luk et al.25.
- Om PFF's te verkrijgen, plaatst u een buis/kolf met 0,5 ml α-Syn (5 mg/ml; Peptide, zie Materiaaltabel) op een shaker bij 37 °C en 250 omw/min gedurende 7 dagen om aggregatie van α-synucleïne te induceren.
- Sonicaat de geaggregeerde α-synucleïne met een amplitude van 20% en een cyclusbelasting van 0,25 totdat een optimale fragmentatie werd bereikt en waargenomen door negatieve kleuring van de monsters met transmissie-elektronenmicroscopie.
- Om mannelijke en vrouwelijke wildtype C57Bl/6 muizen (3 maanden oud) voor te bereiden op striatale PFF-injecties, dient u Meloxicam/Metacam (5 mg/kg) in zoutoplossing subcutaan toe. Dien ook 1 ml van de steriele zoutoplossing toe via twee subcutane injecties van 0,5 ml per dier. Deze behandelingen voorkomen uitdroging, ontstekingen en pijn.
- Induceer anesthesie met 4% isofluraan en 0,7 l/min O2 in een inductiekamer. Controleer de diepte van de anesthesie door het gebrek aan pedaalrespons.
- Scheer het bovenste deel van de muizenkop en plaats het dier voorzichtig in het frame van het stereotactische apparaat op een warmtemat.
- Houd het anesthesievlak in stand door tijdens het hele injectieproces inhalatie-anesthesie bij dieren (1%-2% isofluraan in 0,7 l/min O2) via een gezichtsmasker toe te dienen.
- Plaats het dier op het stereotactische frame. Desinfecteer het operatiegebied met drie rondes afwisselend chloorhexidine-scrub en 70% ethanol. Breng Marcaïne/Bupivacaïne lokaal aan (ongeveer 100 μL) als een subcutane infiltratie van 0,25%.
- Maak een incisie van 0,5 cm in de huid om de schedel bloot te leggen en boor een gat met een diameter van 1 mm in de schedel om het hersenoppervlak bloot te leggen, in de volgende coördinaten van Bregma: - 0,5 mm anteroposterieur, +/− 2,5 mm mediolateraal.
- Injecteer 1,5 l PFF's verkregen in stap 2.2 door stereotactische toediening op de in stap 2.8 aangegeven coördinaten van Bregma en -2,7 mm dorsoventraal (van de bovenste hersenen) met een stroomsnelheid van 100 nl/min met een 32-G Hamilton-spuit. Trek de spuit 5 minuten na de injectie op.
- Hecht (maat: 4-0, 45 cm, zie Materiaaltabel) de wond met drie tot vijf hechtingen indien nodig, en hecht elk van hen met 2 dubbele knopen en vervolgens een enkele knoop. Stop het inademen van de verdoving en haal de muis uit het frame.
- Laat de muis herstellen in een geschikte herstelkooi voordat u hem terugplaatst in zijn thuiskooi.
- Voer de volgende week dagelijkse postoperatieve controles uit. De pijn, angst of het ongemak van elk dier moet elke 24 uur worden gedoseerd met Meloxicam/Metacam zoals aangegeven in stap 2.3.
- Injecteer drie maanden later 300 μL 200 mg/ml natriumpentobarbital in een zoutoplossing via een intraperitoneale injectie. Zodra de pijnreflex verloren is, maakt u een incisie (2-3 cm) op de borst en tilt u de ribben op om het hart bloot te leggen.
- Transcardieel perfuseren met 10 ml PBS en 35 ml 4% paraformaldehyde in PBS, de een na de ander met 5 ml/min met behulp van een spuit van 50 ml die is aangesloten op een vlindernaald van 23 G.
- Verwijder de hersenen en fixeer 4% PFA gedurende nog eens 24 uur bij 4 °C. Bewaar het in 70% ethanol bij 4 °C na PFA-behandeling.
- Plaats de hersenen in geschikte plastic inbeddingsdozen (zie Tabel met materialen) en incubeer in 95% ethanol gedurende 1 uur bij R.T. Herhaal de stap in verse 95% ethanol en incubeer opnieuw gedurende 1 uur.
- Breng de hersenen over naar 100% ethanol gedurende 1 uur bij R.T. Herhaal de stap in verse 100% ethanol en incubeer opnieuw gedurende 1 uur.
- Breng de hersenen over in xyleen of xyleenvervanger gedurende 1 uur bij R.T. Herhaal in verse oplossing en incubeer opnieuw gedurende 1 uur.
- Verwijder het xyleen of xyleenvervanger en incubeer het monster gedurende 1 uur in warme paraffine. Vervang de paraffine en incubeer nog een uur.
- Monteer de hersenen op de inbeddingsdozen met warme paraffine en laat ze een nacht drogen. Bereid secties van 5 μm voor met behulp van een microtoom (zie Tabel met materialen) en monteer ze op glasplaatjes.
3. Mitochondriale morfologieanalyse door immunohistochemie op in paraffine ingebedde hersenplakjes van PFF-geïnjecteerde muizen
- Dewax de objectglaasjes door ze tien keer in xyleenvervanger te dompelen. Incubeer de objectglaasjes gedurende 2 minuten in xyleenvervanger. Dompel opnieuw tien keer in xyleenvervanger.
OPMERKING: Deze stap is nodig om de paraffine te verwijderen en de rehydratatie van de monsters mogelijk te maken. - Rehydratatie: herhaal de procedure beschreven in stap 3.1 met de volgende oplossingen: 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH en tweemaal met ddH2O in volgorde.
- Voer antigeenextractie en immunokleuring uit door de onderstaande stappen te volgen.
- Begin met het overbrengen van de monsters in een magnetronbestendige container met ddH2O.
- Verwarm 100x citraatbuffer pH 6 (zie materiaaltabel) bij 4 °C (wasmiddelen kunnen zijn neergeslagen) en bereid 350 ml verse 1x citraatbuffer. Giet vervolgens de citraatbuffer in een handig plastic bakje met deksel.
- Plaats de glaasjes in de citraatbufferbak (KRITIEK: controleer of de glaasjes zich onder het niveau van de buffer bevinden) en doe het deksel erop.
LET OP: Zorg ervoor dat het deksel NIET volledig gesloten is, anders kan de container barsten in de magnetron. - Magnetron op 700 W: 4 min + 5 min rust, 1,5 min + 5 min rust. Citraatbuffer bijvullen en opnieuw in de magnetron 1,5 min + 5 min rust, 1,5 min + 5 min rust, 1,5 min + 5 min rust.
- Koel de monsters af in citraatbuffer op ijs gedurende 20 minuten. Was het monster met ddH2O.
OPMERKING: Het ophalen van antigeen kan variëren afhankelijk van de specifieke vereisten voor antilichamen.
- Droog de monsterglaasjes af met keukenpapier zonder de tissue aan te raken. Teken rechthoeken met een pappen (zie Tabel met materialen) rond de stukjes weefsel.
- Breng alle objectglaasjes over in een doos met immuunvlekken en was ze een paar keer voorzichtig met TBS + 0,05 % TWEEN (TBS-T). Controleer of TBS-T-druppels binnen de rechthoeken van de pap-pen blijven.
- Verwijder TBS-T uit de monsters door op keukenpapier te tikken. Voeg 50 μL van een blokkerende oplossing (10% NDS in TBS-T) toe aan elke rechthoek (zonder het weefsel aan te raken) en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
OPMERKING: Volumes kunnen variëren afhankelijk van de grootte van het weefsel; Probeer ervoor te zorgen dat: (1) het PAP-gebied vergelijkbaar is voor alle monsters, en (2) het gebied volledig wordt bedekt door het gekozen buffervolume. - Verwijder de blokkerende oplossing uit de monsters door op keukenpapier te tikken. Pipetteer voorzichtig 50 μL/rechthoek van het volgende primaire antilichaammengsel in TBS-T: anti-tyrosinehydroxylase 1:250 samen met anti-VDAC1 1:100 en anti-pSer129 α-synucleïne EP1536Y 1:2000 (zie materiaaltabel).
- Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Wassen door TBS-T op de objectglaasjes te pipetteren en verwijder het door op keukenpapier te tikken. Herhaal dit drie keer.
- Voeg door pipetteren 50 μL/rechthoek van het secundaire antilichaammengsel toe: groene secundaire anti-kip, rode secundaire anti-muis en verrood secundair anti-konijn 1:1000 in TBS-T (zie materiaaltabel). Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur in het donker.
- Was driemaal met TBS-T zoals beschreven in stap 3.13.
- Incubeer met DAPI 2 μg/ml in TBS-T gedurende 1 minuut. Verwijder de DAPI-oplossing door op keukenpapier te tikken. Was driemaal met TBS-T zoals beschreven in stap 3.13.
- Monteer een glazen dekglaasje op de monsters met behulp van 2 druppels/schuif montagereagens (zie Materiaaltabel). Druk zachtjes op het dekglaasje om luchtbellen te verwijderen en laat de monsters 1 uur drogen bij R.T. Bewaar daarna bij 4 °C in het donker.
- Breng ten minste 50 cellen in verschillende velden in beeld met behulp van een fluorescentiebeeldvormingssysteem met gestructureerde verlichting dat is uitgerust met 60x olieobjectieven of confocale technologie.
- Voer een analyse uit van het VDAC1-signaal van afzonderlijke cellen met behulp van Fiji zoals aangegeven in de volgende stappen.
- Selecteer en isoleer eerst het interessegebied (ROI) door een contour rond de positieve of negatieve cel te tekenen (indien van toepassing) en de functie "Bijsnijden" te gebruiken. Om vertekening bij de ROI-selectie te voorkomen, kiest u deze door rekening te houden met het fluorescentiesignaal van een marker die geen verband houdt met de analyse (d.w.z. geen mitochondriale marker).
- Optioneel: als de afbeelding te korrelig is, gebruik dan de functie "vloeiend" om een hogere randdefinitie te verkrijgen.
OPMERKING: Als de functie vloeiend op een afbeelding wordt toegepast, pas deze dan toe op alle volgende afbeeldingen. - Optioneel: gebruik de functie "Convolve" (Kernelmodus, in Process > Filters) om de achtergrond te verkleinen.
NOTITIE: Dit is optioneel en meestal niet nodig bij het gebruik van secties van 5 m vanwege de dunnere aard van de secties. - Activeer de vormbeschrijvingen en beperk de drempelopties op de functie "Meting instellen" (zorg ervoor dat deze via de analyse worden geactiveerd).
- Selecteer in het menu "Aanpassen" de drempelfunctie en pas het drempelniveau aan. De drempelwaarden moeten voor alle cellen van hetzelfde monster worden gehandhaafd.
- Probeer te zorgen voor een adequate visualisatie van het mitochondriale netwerk, zoals weergegeven in de representatieve afbeeldingen van dit artikel, terwijl u achtergrondpixels weggooit.
- Gebruik de tool Deeltjes analyseren op het tabblad Analyseren. Stel een geschikte grootte in om de mitochondriën vast te leggen. In dit voorbeeld activeert size: 25-Infinity, activeer: Pixeleenheden en selecteer: Weergeven: Maskers zijn gebruikt om het resultaat te visualiseren. Fiji berekent en toont de tellingen, beeldverhouding (AR) en andere vormparameters in een nieuw paneel.
- Voer waar nodig een statistische analyse van de gegevens uit. In dit experiment werd de t-test gebruikt om het verschil in gemiddelde beeldverhouding (AR) en tellingen berekend door Fiji tussen de experimentele groepen te analyseren na normaliteitstesten met de normaliteitstests van D'Agostino en Pearson.
Representative Results
Om ervoor te zorgen dat de juiste beeldvormings- en analyseomstandigheden aanwezig zijn voor de in-situ evaluatie van de mitochondriale morfologie in weefsel, wordt een in-vitro-exploratie van de mitochondriale morfologie aanbevolen als reactie op een bekende modulator van de mitochondriale morfologie (deel 1). SNCA werd bijvoorbeeld genetisch tot overexpressie gebracht in SH-SY5Y-cellen om veranderingen in de mitochondriale morfologie te induceren, zoals eerder beschreven26. Andere beledigingen die kunnen worden gebruikt als controle om de mitochondriale morfologie te verslechteren, zijn uithongering of het gebruik van mitochondriale activiteitsremmers zoals MPP+. Cellen werden getransfecteerd en gekleurd voor α-synucleïne (AS) om SNCA+ (AS+) en SNCA- (AS-) cellen te scheiden. Ze werden ook gekleurd met TOMM2027 om het mitochondriale netwerk van cellen te visualiseren. Om deze analyse zo veel mogelijk te laten lijken op die van een weefselcoupe van 5 μm, werd één confocaal vlak geanalyseerd in tegenstelling tot een maximale projectie van meerdere vlakken. Morfologische analyse van één confocaal vlak van TOMM20 onthulde dat zowel het totale aantal mitochondriën als hun beeldverhouding of AR (die correleert met de verlenging van het organel) werden verminderd als reactie op SNCA-overexpressie (Figuur 1).
Immunokleuring werd uitgevoerd voor het mitochondriale eiwit VDAC1 in in paraffine ingebedde hersensecties van muizen van 5 μm van dieren die waren geïnjecteerd met PFF's, zoals beschreven in het protocolgedeelte hierboven. Substantia nigra pars compacta (SNc) dopaminerge neuronen, die degeneratie ondergaan bij PD, werden onthuld door co-immunokleuring met anti-tyrosinehydroxylase (TH) en werden regionaal gescheiden van het ventrale tegmentale gebied en de substantia nigra pars lateralis. Aan de andere kant stelde anti-fosfoSer129-α-synucleïne (pS129)-kleuring ons in staat om cellen met pS129-laesies te onderscheiden van gezonde cellen (pS129+ versus pS129-). Er werden SNc-beelden van drie verschillende dieren gemaakt, en de daaropvolgende beeldanalyse van VDAC1-kleuring van TH-positieve neuronen onthulde een vermindering van zowel het aantal mitochondriën als de beeldverhouding tussen neuronen met pS129-laesies en neuronen zonder deze (Figuur 2). Deze resultaten geven aan dat de mitochondriale morfologie van neuronen met pS129-laesies is aangetast in vergelijking met die van cellen zonder pS129-laesies.
Hoewel dit specifieke experiment een vermindering van de AR laat zien, waardoor een vermindering van de verlenging van mitochondriën wordt benadrukt, samen met een vermindering van de globale tellingen, wat wijst op een verslechtering van de mitochondriale morfologie, moet de interpretatie van de gegevens afhankelijk zijn van het experiment. Een vermindering van AR en tellingen kan bijvoorbeeld wijzen op een globale vermindering van de mitochondriale inhoud en fragmentatie, terwijl een vermindering van AR maar een toename van de globale tellingen zou wijzen op een mitochondriaal fragmentatiefenotype. Daarom is het belangrijk om de gegevens in de context van beide maatregelen te interpreteren.
Figuur 1: Mitochondriale morfologie in een SNCA-overexpressie in vitro model. Co-immunokleuring voor TOMM20 (groen), α-synucleïne (AS, rood) en DAPI (blauw) op SNCA-cellen met overexpressie en niet tot overexpressie (respectievelijk AS+ en AS-) (A). Detail van een AS-cel (B) en een AS+ cel (C). Zwart-witbeelden in panelen (B) en (C) vertegenwoordigen de maskers van het TOMM20-signaal na toepassing van de Fiji-functie die wordt beschreven in de sectie Protocol. Dit masker maakt het mogelijk om de vorm van de resulterende structuren te kwantificeren. Mitochondriale tellingen en Aspect Ratio (AR)-waarden van AS- en AS+-cellen (N = 25 cellen per aandoening) werden gekwantificeerd en weergegeven als individuele waarden en als gemiddelde ± SEM; **p-waarde < 0,05 t-test (D). De normaliteit werd beoordeeld door middel van de normaliteitstests van D'Agostino en Pearson. Schaalbalken: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mitochondriale morfologie wordt beïnvloed in neuronen die pS129-laesies herbergen. Co-immunokleuring voor TH (groen), VDAC1 (rood), fosfoS129-α-synucleïne (magenta) en DAPI (blauw) van de SNc van PFF-geïnjecteerde muizen (A). Het detail van een fosfoS129-α-synucleïne-negatief (pS129-) dopaminerge neuron (B) en van een fosfoS129-α-synucleïne-positief (pS129+) dopaminerge neuron (C). Zwart-witbeelden in panelen (B) en (C) vertegenwoordigen de maskers van het TOMM20-signaal na toepassing van de Fiji-functie die wordt beschreven in de sectie Protocol. Dit masker maakt het mogelijk om de vorm van de resulterende structuren te kwantificeren. Negatieve en positieve cellen werden geteld in monsters van drie verschillende dieren, zoals geïllustreerd door de verschillende kleuren van de individuele grafische waarden (blauw, groen en oranje). Mitochondriale tellingen en AR-kwantificering van pS129- (N = 29) versus pS129+ (N = 22) in dopaminerge neuronen werden weergegeven als gemiddelde ± SEM en individuele celwaarden; **p-waarde < 0,05 t-toets (D). De normaliteit werd beoordeeld door middel van de normaliteitstests van D'Agostino en Pearson. Schaalbalken: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Over het algemeen toont deze studie aan dat immunokleuring in combinatie met beeldanalyse een betrouwbare methode is voor het analyseren van mitochondriale morfologie. In feite maakt het het mogelijk om het aantal mitochondriën te kwantificeren, evenals enkele morfologische parameters zoals de beeldverhouding in zowel celkweek als weefsel. Het aantal mitochondriën is direct gekoppeld aan de functionele status van de splijtings- en fusiemechanismen van de monsters, terwijl de AR-waarde afhankelijk is van de rek van het organel. Deze methode kan bijzonder waardevol zijn voor de snelle evaluatie van de mitochondriale afwijkingen in modellen van PD waarin veranderde mitochondriale morfologie, dynamiek en functies bekende pathologische mechanismen zijn28,29. α-synucleïne speelt ook een relevante rol bij de ziekte van Parkinson: α-synucleïne is inderdaad een van de componenten van Lewy Bodies, de cytoplasmatische fibrillaire aggregaten die worden gebruikt voor postmortale diagnose van PD-patiënten30. Bovendien werden mutaties in het SNCA-gen gevonden bij patiënten met zowel bekende als sporadische PD (besproken in31). Van fosforylering van α-synucleïne bij Ser129 is uitgebreid aangetoond dat het Lewy-Body-achtige pathologie labelt, die ontstaat na PFF-belediging en verschillende toxische effecten uitlokt32,26.
Met behulp van de hier gepresenteerde tool waren we in staat om een vermindering van het mitochondriale aantal en AR-waarden te detecteren in de aanwezigheid van zowel overexpressie als geaggregeerde α-synucleïne (cellen met α-synucleïnekleuring en neuronen met respectievelijk fosfoSer129α-synucleïne-positieve laesies) in vergelijking met cellen zonder dergelijke laesies (α-synucleïne- en fosfoS129α-synucleïne-negatieve cellen). Deze resultaten komen overeen met eerdere rapporten die laten zien hoe directe interacties tussen α synucleïne en mitochondriën toxische effecten hebben op de mitochondriale functie en homeostase bij PD26,33, 34. Er werd inderdaad gemeld dat muizen met α-synucleïnemutaties verhoogde mitochondriale DNA-schade vertonen35 en mitofagie36,37. Bovendien werd beschreven dat verhoogde α-synucleïnespiegels mitochondriale splijting/fragmentatie bevorderen, reactieve zuurstofsoorten in mitochondriën induceren en de expressie van mitochondriale eiwitten in cellijnen en muismodellen tot overexpressie brengen van α-synucleïne tot overexpressie 26,38,39.
Het is belangrijk om te benadrukken dat deze tool sterk afhankelijk is van de antilichamen die voor het onderzoek worden gebruikt; Zorgvuldige morfologische evaluatie van de gebruikte antilichaamkleuring is absoluut noodzakelijk om het juiste subcellulaire compartiment te detecteren. Aangezien deze techniek gebaseerd is op secties van 5 μm en daarom enkelvoudige brandpuntsvlakken vereist voor de analyse van de mitochondriale structuren, sluit de afwezigheid van een fenotype het bestaan van een fenotype niet uit, aangezien het mogelijk is dat subtiele verschillen in mitochondriale morfologie niet met deze methode worden gedetecteerd.
Hoewel dit werk en anderen eerder vergelijkbare benaderingen hebben gebruikt om mitochondriale morfologie in vivo40 te evalueren, is er behoefte aan een gedetailleerd protocol dat voor deze beoordeling toegankelijk moet worden gemaakt voor de onderzoeksgemeenschap. Het belang van deze studie is dat het mogelijk is om deze methode toe te passen op verschillende in vivo ziektemodellen om mitochondriale morfologische afwijkingen te beoordelen en mogelijke pathologie te identificeren, wat uiteindelijk de screening van loodverbindingen voor de behandeling van dergelijke aandoeningen kan vergemakkelijken. Hoewel deze analyse momenteel beperkt is tot in paraffine ingebed weefsel, is het voordeel van de methode dat deze kan worden toegepast op elk ziektemodel na terminale weefselverzameling, waardoor het een zeer veelzijdig hulpmiddel is.
Disclosures
Wij wensen geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
We willen de financiers van deze studie erkennen, met name Ikerbasque, het Spaanse Ministerie voor Wetenschap en Innovatie, de Michael J Fox Foundation, IBRO en het Achucarro Basque Center for Neuroscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 G Hamilton syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 4/0 USP 45 cm suture | SSa90 pga | 32345n-36u | |
| Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse | Invitrogen | A21202; A21203 | green/red dye-Donkey anti-Mouse |
| Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit | Invitrogen | A21207 A31573 | red/far red dye-Donkey anti-Rabbit |
| AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | green dye-Donkey anti-Chicken |
| Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody | Abcam | ab51253 | |
| Anti-TOM 20 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-17764 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody | Abcam | ab76442 | |
| Anti-VDAC1 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-390996 | |
| Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) | Abcam | ab138501 | |
| Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) | Home-made | ||
| Disposable base mold for tissue embedding | Fisher | 22-363-553 | Plastic embedding boxes |
| D-MEM F12 | Gibco | A321331020 | |
| EVOS M7000 Imaging System | ThermoFisher Scientific | High-content automated fluorescence microscope | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| Flat optical bottom 96 well plates | Greiner | 675090 | |
| FluorSave Reagent | Millipore | 345789-20ML | Mounting reagent |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-024 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | PAP-pen |
| Lipofectamine and Plus Reagent | Invitrogen | 11668-019; 11514-015 | Transfection reagent and transfection adjuvant |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | ||
| Normal Donkey Serum | Gibco | PCN5000 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection medium |
| PCDNA4 plasmid (backbone) | Addgene | 41036 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| SH-SY5Y cells/well | ATCC | HTB-11 | |
| Xylene substitute | Labbox | 22L36504 | |
| Zeiss Axio Imager Apotome 2 | Carl Zeiss | Structured illumination fluorescence imaging system | |
| α-synuclein peptide | rpeptide | S-1010-2 |
References
- Yang, Y., Lu, B. Mitochondrial morphogenesis, distribution, and parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (9), 953-963 (2009).
- Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Hedrich, K., et al. type, and origin of Parkin mutations: Review and case studies. Movement Disorders. 19 (10), 1146-1157 (2004).
- Kahle, P. J., Haass, C. How does parkin ligate ubiquitin to Parkinson's disease. EMBO reports. 5 (7), 681-685 (2004).
- Dawson, T. M., Dawson, V. L. The role of parkin in familial and sporadic Parkinson's disease. Movement Disorders. 25, S32-S39 (2010).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The Roles of PINK1, Parkin, and Mitochondrial Fidelity in Parkinson's Disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Bonifati, V., et al. DJ-1(PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurological Sciences. 24 (3), 159-160 (2003).
- Chia, S. J., Tan, E. -K., Chao, Y. -X. Historical Perspective: Models of Parkinson's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2464 (2020).
- Wilson, D. M., Cookson, M. R., Den Bosch, L. V. an, Zetterberg, H., Holtzman, D. M., Dewachter, I.
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M.
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 22 (1), 123-144 (1999).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Okamoto, K., Shaw, J. M. Mitochondrial Morphology and Dynamics in Yeast and Multicellular Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 39 (1), 503-536 (2005).
- Malpartida, A. B., Williamson, M., Narendra, D. P., Wade-Martins, R., Ryan, B. J. Mitochondrial Dysfunction and Mitophagy in Parkinson's Disease: From Mechanism to Therapy. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 329-343 (2021).
- Zou, W., et al. Nanoscopic quantification of sub-mitochondrial morphology, mitophagy and mitochondrial dynamics in living cells derived from patients with mitochondrial diseases. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 136 (2021).
- Navaratnarajah, T., Anand, R., Reichert, A. S., Distelmaier, F. The relevance of mitochondrial morphology for human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 134, 105951 (2021).
- Zambon, F., et al. Cellular α-synuclein pathology is associated with bioenergetic dysfunction in Parkinson's iPSC-derived dopamine neurons. Human Molecular Genetics. 28 (12), 2001-2013 (2019).
- Cherubini, M., Lopez-Molina, L., Gines, S. Mitochondrial fission in Huntington's disease mouse striatum disrupts ER-mitochondria contacts leading to disturbances in Ca2+ efflux and Reactive Oxygen Species (ROS) homeostasis. Neurobiology of Disease. 136, 104741 (2020).
- Parihar, M. S., Parihar, A., Fujita, M., Hashimoto, M., Ghafourifar, P. Alpha-synuclein overexpression and aggregation exacerbates impairment of mitochondrial functions by augmenting oxidative stress in human neuroblastoma cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 2015-2024 (2009).
- Wiemerslage, L., Lee, D. Quantification of mitochondrial morphology in neurites of dopaminergic neurons using multiple parameters. Journal of Neuroscience Methods. 262, 56-65 (2016).
- Liu, Y. -T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Shoshan-Barmatz, V., Shteinfer-Kuzmine, A., Verma, A. VDAC1 at the intersection of cell metabolism, apoptosis, and diseases. Biomolecules. 10 (11), 1485 (2020).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein transmission initiates parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Ryan, B. J., et al. REST protects dopaminergic neurons from mitochondrial and α-synuclein oligomer pathology in an alpha synuclein overexpressing BAC-transgenic mouse model. The Journal of Neuroscience. 41 (16), 3731-3746 (2021).
- Yamamoto, H., et al. Dual role of the receptor Tom20 in specificity and efficiency of protein import into mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 91-96 (2011).
- Exner, N., Lutz, A. K., Haass, C., Winklhofer, K. F. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: molecular mechanisms and pathophysiological consequences. The EMBO Journal. 31 (14), 3038-3062 (2012).
- Grünewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American journal of pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Vázquez-Vélez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44 (1), 87-108 (2021).
- Mahul-Mellier, A. -L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply α-synuclein fibrillization, is one of the major drivers of neurodegeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (9), 4971-4982 (2020).
- Ganguly, U., et al. Interaction of α-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells: implications in the pathogenesis of Parkinson's disease. Biochemical Journal. 477 (6), 1109-1122 (2020).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Martin, L. J., et al. Parkinson's Disease α-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. The Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
- Choubey, V., et al. Mutant A53T α-Synuclein induces neuronal death by increasing mitochondrial autophagy. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10814-10824 (2011).
- Chen, L., Xie, Z., Turkson, S., Zhuang, X. A53T Human α-synuclein overexpression in transgenic mice induces pervasive mitochondria macroautophagy defects preceding dopamine neuron degeneration. The Journal of Neuroscience. 35 (3), 890-905 (2015).
- Kamp, F., et al. Inhibition of mitochondrial fusion by α-synuclein is rescued by PINK1, Parkin and DJ-1. The EMBO Journal. 29 (20), 3571-3589 (2010).
- Nakamura, K., et al. Direct membrane association drives mitochondrial fission by the parkinson disease-associated protein α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20710-20726 (2011).
- Park, J., et al. Abnormal mitochondria in a non-human primate model of MPTP-induced Parkinson's disease: Drp1 and CDK5/p25 signaling. Experimental Neurobiology. 28 (3), 414-424 (2019).
