Summary
Denna studie presenterar en metod för att analysera mitokondriernas morfologi baserat på immunfärgning och bildanalys i mushjärnvävnad in situ. Den beskriver också hur detta gör det möjligt att upptäcka förändringar i mitokondriell morfologi inducerad av proteinaggregering i Parkinsons sjukdomsmodeller.
Abstract
Mitokondrier spelar en central roll i cellernas energimetabolism, och deras funktion är särskilt viktig för nervceller på grund av deras höga energibehov. Därför är mitokondriell dysfunktion ett patologiskt kännetecken för olika neurologiska störningar, inklusive Parkinsons sjukdom. Mitokondriernas form och organisation är mycket plastisk, vilket gör att cellen kan reagera på miljösignaler och behov, och mitokondriernas struktur är också nära kopplad till deras hälsa. Här presenterar vi ett protokoll för att studera mitokondriell morfologi in situ baserat på immunfärgning av mitokondrieproteinet VDAC1 och efterföljande bildanalys. Detta verktyg kan vara särskilt användbart för studier av neurodegenerativa sjukdomar eftersom det kan upptäcka subtila skillnader i mitokondriellt antal och form inducerade av aggregat av α-synuklein, ett aggregeringsbenäget protein som är starkt involverat i patologin vid Parkinsons sjukdom. Denna metod gör det möjligt att rapportera att substantia nigra pars compacta dopaminerga neuroner som hyser pS129-lesioner visar mitokondriell fragmentering (vilket antyds av deras reducerade Aspect Ratio, AR) jämfört med deras friska närliggande neuroner i en förformad fibrill intrakraniell injektion Parkinson-modell.
Introduction
Det centrala nervsystemet har en intensiv efterfrågan på ATP: neuroner använder ATP för att stödja jongradienter, neurotransmittorsyntes, synaptisk vesikelmobilisering, frisättning och återvinning och för att möjliggöra lokal proteinöversättning och nedbrytning. Mer än 95 % av det ATP som används av hjärnan produceras av mitokondrierna1. Därför är det inte förvånande att mitokondriell dysfunktion är särskilt skadlig för nervceller. Faktum är att mitokondriella funktionsnedsättningar spelar en viktig roll i flera neurologiska sjukdomar, inklusive neurodegenerativa tillstånd, såsom Parkinsons sjukdom (PD) och Alzheimers sjukdom (AD)2,3.
Flera gener är entydigt kopplade till PD-kodande proteiner som är relevanta för mitokondriell funktion och homeostas, såsom Parkin 4,5,6, PTEN-inducerat kinas 1 (PINK1)7,8 och DJ-19. Ytterligare bevis för en roll för mitokondriell dysfunktion vid Parkinsons sjukdom är att behandlingar med hämmare av komplex I i mitokondriernas elektrontransportkedja (såsom rotenon och MPTP) rekapitulerar flera aspekter av PD in vitro och in vivo10. Det är dock viktigt att konstatera att många patologiska processer kan driva neuronal förlust vid Parkinsons sjukdom, tillsammans med mitokondriella brister: oxidativ stress, förändrad kalciumhomeostas, fel på ubiquitin-proteasomen och autofagi-lysosomala system och proteinaggregering är bland de mest studerade (granskade i 11,12,13 och).
Mitokondrier är heterogena till formen: förutom enskilda enheter finns de vanligtvis som förlängda retikulära och rörformiga nätverk. Mitokondriernas struktur och cellulära placering är avgörande för deras funktion14; Faktum är att mitokondriella nätverk är extremt dynamiska och genomgår frekventa processer av fission, fusion och mitofagi för att möta cellernas behov och för att svara på miljösignaler15,16. Dessutom är mitokondriernas morfologi intimt kopplad till deras hälsotillstånd. Till exempel, vid human optisk atrofi, leder genetiska mutationer som minskar mitokondriell aktivitet till onormala, smala och hyperfusionerade mitokondrier17. Å andra sidan uppvisar en mängd olika mänskliga sjukdomar avvikande mitokondriell morfologi, inklusive mitokondriell fragmentering eller överdriven mitokondriell fusion, som har skadliga effekter på mitokondriell funktion (granskad i18). I samband med Parkinsons sjukdom har vi och andra tidigare visat att onormal mitokondriell form korrelerar med dysfunktion som svar på α-synukleinaggregat19. Medan mitokondriell morfologi har studerats utförligt in vitro både i samband med PD och andra sjukdomar 20,21,22, saknas protokoll för utvärdering av mitokondriell morfologi från in vivo-sektioner. Detta gör in vivo-studien av mitokondrier i samband med sjukdomar som Parkinsons sjukdom starkt beroende av transgena djur23 eller utvärderingen av extrakt från mellanhjärnan som inte kan ge cellulär upplösning.
Här presenteras ett protokoll för att studera mitokondriernas morfologi in situ som en indikator på deras funktionella status och hälsa, baserat på immunfärgning av det mitokondriella proteinet VDAC124 följt av bildanalys i paraffininbäddade vävnadssnitt. Vi visar också resultaten av detta protokoll i in vitro och in vivo PD-modeller: neuroblastomceller som överuttrycker SNCA (Synuclein Alpha) och hjärnvävnad från möss som utsatts för intrakraniell injektion av α-synuklein Pre-Formed Fibriller (PFF). Samtidig immunfärgning med en antikropp mot α-synuklein (i celler) eller fosfoSer129-α-synuklein pS129 (i mushjärnor) gjorde det möjligt för oss att identifiera celler med aggregerad proteinpatologi (överuttryckt α-synuklein respektive α-synukleinfibriller) i proverna, medan negativa celler fungerade som en icke-patologisk kontroll i samma prover. Genom denna analys och de data som beskrivs här observerades ett reducerat bildförhållande, vilket indikerar fragmentering av mitokondrier i celler som överuttrycker SNCA eller uppvisar pS129-lesioner.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i detta avsnitt har utförts i enlighet med den etiska ram som tillhandahålls av Baskiens universitet referens M20/2022/212, Baskiens regering, den spanska regeringen och Europeiska unionen.
1. Mitokondriell morfologianalys i SNCA-överuttryckande SH-SY5Y-celler
OBS: Här ges en kort beskrivning av genereringen av in vitro-materialet för studien, som kommer att fungera som en jämförelse för de in situ erhållna resultaten. Det rekommenderas att denna typ av analys utförs innan ett in vivo-experiment för mitokondriell morfologi inleds, eftersom det kommer att säkerställa att alla lämpliga avbildnings- och analysinställningar finns på plats.
- För att öka cellbindningen och underlätta cellulär vidhäftning på platta 96-hålsplattor med optisk botten, tillsätt 25 μL/brunn av beläggningsmatris 1:1000 i DMEM F12 genom pipettering (se materialförteckning). Inkubera plattorna i 1 timme vid 37 °C och 5 % CO2 %.
- Räkna SH-SY5Y med Neubauer-kammare. Avlägsna beläggningsmatrisen genom pipettering och sådd 10 000 celler/brunn på den belagda 96-hålsplattan i 50 μL/brunn av DMEM F-12 kompletterat med 10 % FBS, 2 mM glutamin och penicillin/streptomycin (se materialförteckning).
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2i 24 timmar.
- Bered en blandning av 250 ng pcDNA3.1 som bär human SNCA av vildtyp, 0,250 μl transfektionsreagens, 0,250 l transfektionsadjuvans och transfektionsmedium upp till 50 μL för varje brunn (se materialförteckning). Förbered en huvudlösning med hänsyn till det totala antalet brunnar i experimentet.
- Avlägsna odlingsmediet genom manuell pipettering och tillsätt 50 μl/brunn av den lösning som beretts i steg 1.4 genom pipettering. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2
- h Efter transfektionen avlägsnas transfektionsmediet med pipettering och 25 μL/brunn av 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS.
VARNING: Paraformaldehyd är ett giftigt fixeringsmedel; Använd lämplig personlig skyddsutrustning. - Inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (R.T). Ta bort fixeringslösningen genom pipettering och tvätta en gång genom att tillsätta 50 μl/brunn PBS. Ta bort PBS genom pipettering.
- Pipettera 25 μL/brunn TBS med 0,05 % Tween (TBS-T) och 10 % normalt åsnesterum (NDS, se Materialförteckning). Inkubera i 1 timme vid R.T. för att blockera alla ospecifika signaler.
- Bered en lösning av kanin-anti-α-synukleinantikropp MJFR1 1:1000 tillsammans med mus-anti-TOMM20-antikropp 1:100 i TBS-T (se materialtabell) enligt antalet brunnar som ska analyseras.
- Ta bort blockeringslösningen från steg 1.8 genom pipettering och tillsätt 25 μl/brunn av blandningen av primära antikroppar som beretts i steg 1.9. Inkubera över natten vid 4 °C.
- Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta tre gånger genom att tillsätta och ta bort 50 μl/brunn TBS-T genom pipettering.
- Bered en lösning av grön sekundär antikropp anti-Mouse 1:1000 tillsammans med röd sekundär antikropp anti-Rabbit 1:1000 i TBS-T (se materialtabell) enligt antalet brunnar som ska analyseras.
- Efter aspirering av PBS från den sista tvätten som beskrivs i steg 1.11, tillsätt 25 μL/brunn av den sekundära antikroppsblandningen med hjälp av en pipett och inkubera plattan i 1 timme vid R.T.
- Avlägsna den sekundära antikroppslösningen genom pipettering och tillsätt 25 μL/brunn 2 g/ml DAPI i TBS-T. Inkubera plattan i 5 min vid R.T.
- Ta bort DAPI-lösningen med en pipett och tvätta tre gånger genom att tillsätta och ta bort 50 μl/brunn TBS-T med en pipett.
- Pipettera 80 μL/brunn PBS med 0,02 % natriumazid och förvara plattan vid 4 °C.
VARNING: Natriumazid är giftigt; Använd lämplig personlig skyddsutrustning. - Ta bilder med ett automatiserat fluorescensmikroskop med högt innehåll eller motsvarande konfokalbildsystem utrustat med ett 60x objektiv (se materialförteckning).
- Utför analys av TOMM20-signalen för enskilda celler med Fiji enligt steg 3.15-3.21. Undvik att celler genomgår apoptos, nekros eller mitos.
OBS: För att göra det utesluter vi från analysen de celler som visar de morfologiska egenskaperna hos apoptos, nekros eller mitos som är synliga under mikroskopet, såsom cellkrympning, membranblebbing, cellavlossning, kärnkondensation, DNA-fragmentering och kondenserat kärnkromatin organiserat i tjocka strängar inriktade i ett enda plan.
2. Generering av PFF och intrakraniella injektioner av PFF hos möss
OBS: Generering av injektionsmaterial och den intrakraniella injektionsprocessen presenteras här. Detta protokoll är anpassat från Luk et al.25.
- För att erhålla PFF, placera ett rör/kolv som innehåller 0,5 ml α-Syn (5 mg/ml; Peptid, se materialtabell) på en shaker vid 37 °C och 250 varv per minut i 7 dagar för att inducera aggregering av α-synuklein.
- Ultraljudsbehandla det aggregerade α-synukleinet vid 20% amplitud och 0,25 cykel tills optimal fragmentering uppnåddes och observerades genom negativ färgning av proverna med transmissionselektronmikroskopi.
- För att förbereda han- och honmöss av vildtyp C57Bl/6 (3 månader gamla) för striatala PFF-injektioner, administrera Meloxicam/Metacam (5 mg/kg) subkutant i koksaltlösning. Administrera även 1 ml av den sterila koksaltlösningen via två 0,5 ml subkutana injektioner per djur. Dessa behandlingar förhindrar uttorkning, inflammation och smärta.
- Inducera anestesi med 4 % isofluran och 0,7 L/min O2 i en induktionskammare. Kontrollera anestesidjupet genom bristen på pedalrespons.
- Raka den övre delen av mushuvudet och för försiktigt in djuret i ramen för den stereotaktiska apparaten på en värmematta.
- Upprätthåll anestesiplanet genom att ge djurinhalationsanestesi (1%-2% isofluran i 0,7 l/minO2) genom en ansiktsmask under hela injektionsprocessen.
- Placera djuret på den stereotaktiska ramen. Desinficera operationsområdet med tre omgångar omväxlande klorhexidinskrubb och 70 % etanol. Applicera Marcaine/Bupivakain lokalt (cirka 100 μL) som en subkutan infiltration på 0,25 %.
- Utför ett 0,5 cm snitt i huden för att exponera skallen och borra ett hål med en diameter på 1 mm i skallen för att exponera hjärnytan, i följande koordinater från Bregma: - 0,5 mm anteroposterior, +/− 2,5 mm mediolateral.
- Injicera 1,5 l PFF erhållna i steg 2.2 genom stereotaktisk tillförsel till de koordinater som anges i steg 2.8 från Bregma och -2,7 mm dorsoventralt (från den övre hjärnan) med en flödeshastighet av 100 nl/min med en 32-G Hamilton-spruta. Dra upp sprutan 5 minuter efter injektionen.
- Sutur (storlek: 4-0, 45 cm, se Materialtabell) såret med tre till fem stygn efter behov, och bind ihop var och en av dem med 2 dubbelknutar och sedan en enkelknut. Stoppa inandningen av bedövningsmedel och ta bort musen från ramen.
- Låt musen återhämta sig i en lämplig uppvakningsbur innan du sätter tillbaka den i sin hembur.
- Under den följande veckan ska du utföra dagliga postoperativa kontroller. Alla djurs smärta, ångest eller obehag ska doseras med Meloxicam/Metacam enligt anvisningarna i steg 2.3 var 24:e timme.
- Tre månader senare injiceras 300 μl 200 mg/ml natriumpentobarbital i koksaltlösning via en intraperitoneal injektion. När smärtreflexen är förlorad, gör ett snitt (2-3 cm) på bröstet och lyft revbenen för att exponera hjärtat.
- Transkardiellt perfundering med 10 ml PBS och 35 ml 4 % paraformaldehyd i PBS efter varandra vid 5 ml/min med en 50 ml spruta ansluten till en 23 G fjärilsnål.
- Ta bort hjärnan och postfix i 4 % PFA i ytterligare 24 timmar vid 4 °C. Förvara den i 70 % etanol vid 4 °C efter PFA-behandling.
- Lägg hjärnan i lämpliga inbäddningslådor av plast (se materialtabell) och inkubera i 95 % etanol i 1 timme vid R.T. Upprepa steget i färsk 95 % etanol och inkubera igen i 1 timme.
- Överför hjärnan till 100 % etanol i 1 timme vid R.T. Upprepa steget i färsk 100 % etanol och inkubera igen i 1 timme.
- Överför hjärnan till xylen eller xylenersättning i 1 timme vid R.T. Upprepa i färsk lösning och inkubera igen i 1 timme.
- Ta bort xylen eller xylenersättningen och inkubera provet i varmt paraffin i 1 timme. Byt ut paraffinet och inkubera i ytterligare en timme.
- Montera hjärnan på inbäddningslådorna med varmt paraffin och låt den torka över natten. Bered 5 μm sektioner med hjälp av en mikrotom (se materialtabell) och montera dem på glasskivor.
3. Mitokondriell morfologianalys med immunhistokemi på paraffininbäddade hjärnskivor från PFF-injicerade möss
- Avvaxa glasen genom att doppa dem i xylenersättning tio gånger. Inkubera objektglasen i 2 minuter i xylenersättning. Doppa igen tio gånger i xylenersättning.
OBS: Detta steg är nödvändigt för att ta bort paraffinet och möjliggöra rehydrering av proverna. - Rehydrering: upprepa proceduren som beskrivs i steg 3.1 med följande lösningar: 100 % EtOH, 95 % EtOH, 70 % EtOH och två gånger med ddH2O i ordning.
- Utför antigenhämtning och immunfärgning enligt stegen nedan.
- Börja med att överföra proverna till en mikrovågsbehållare med ddH2O.
- Värm upp 100x citratbuffert pH 6 (se materialtabell) förvarad vid 4 °C (rengöringsmedel kan ha fällts ut) och förbered 350 ml färsk 1x citratbuffert. Häll sedan citratbufferten i en praktisk plastbehållare med lock.
- Lägg objektglasen i citratbuffertbehållaren (KRITISK: kontrollera att objektglasen är under buffertnivån) och sätt på locket.
VARNING: Se till att locket INTE är helt stängt, annars kan behållaren spricka i mikrovågsugnen. - Mikrovågsugn på 700 W: 4 min + 5 min vila, 1,5 min + 5 min vila. Fyll på citratbuffert och mikrovågsugn igen 1,5 min + 5 min vila, 1,5 min + 5 min vila, 1,5 min + 5 min vila.
- Kyl ner proverna i citratbuffert på is i 20 min. Tvätta provet med ddH2O.
OBS: Antigenhämtning kan variera beroende på specifika antikroppskrav.
- Torka provglasen med pappershandduk utan att vidröra vävnaden. Rita rektanglar med en penna (se Materialförteckning) runt vävnadsbitarna.
- Överför alla objektglas till en glasimmunfärgningslåda och tvätta ett par gånger försiktigt med TBS + 0,05 % TWEEN (TBS-T). Kontrollera att TBS-T-dropparna stannar kvar i pap-pen-rektanglarna.
- Ta bort TBS-T från samples genom att knacka på pappershandduk. Tillsätt 50 μL av en blockerande lösning (10 % NDS i TBS-T) i varje rektangel (utan att vidröra vävnaden) och inkubera i 1 timme vid RT.
OBS: Volymerna kan variera beroende på vävnadens storlek; Försök att se till att: (1) det PAP-pennade området är likartat i alla prover, och (2) området är helt täckt av den valda buffertvolymen. - Ta bort den blockerande lösningen från proverna genom att knacka på en pappershandduk. Pipettera försiktigt 50 μL/rektangel av följande primära antikroppsblandning i TBS-T: anti-tyrosinhydroxylas 1:250 tillsammans med anti-VDAC1 1:100 och anti-pSer129 α-synuklein EP1536Y 1:2000 (se Materialförteckning).
- Inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta genom att pipettera TBS-T på objektglasen och ta bort det genom att knacka på hushållspapper. Upprepa tre gånger.
- Tillsätt genom pipettering av 50 μL/rektangel av den sekundära antikroppsblandningen: grön sekundär anti-kyckling, röd sekundär anti-mus och den långt röda sekundära anti-kaninen 1:1000 i TBS-T (se materialförteckning). Inkubera vid 37 °C i 1 timme i mörker.
- Tvätta tre gånger med TBS-T enligt beskrivningen i steg 3.13.
- Inkubera med DAPI 2 μg/ml i TBS-T i 1 min. Ta bort DAPI-lösningen genom att knacka på hushållspapper. Tvätta tre gånger med TBS-T enligt beskrivningen i steg 3.13.
- Montera ett glastäcke på samples med 2 droppar/glas monteringsreagens (se materialtabell). Tryck försiktigt på täckglaset för att eliminera bubblor och låt proverna torka i 1 timme på R.T. Förvara sedan vid 4 °C i mörker.
- Avbilda minst 50 celler i olika fält med hjälp av ett strukturerat fluorescensavbildningssystem med belysning utrustat med 60x oljeobjektiv eller konfokalteknik.
- Utför analys av VDAC1-signalen för enskilda celler med Fiji enligt följande steg.
- Välj och isolera först intresseområdet (ROI) genom att rita en kontur runt den positiva eller negativa cellen (efter behov) och använda funktionen "Beskär". För att undvika bias i ROI-valet, välj det genom att ta hänsyn till fluorescenssignalen för en markör som inte är relaterad till analysen (dvs. inte en mitokondriell markör).
- Valfritt: om bilden är överdrivet pixlad, använd "smooth"-funktionen för att få en högre kantdefinition.
OBS: Om den släta funktionen tillämpas på en bild, använd den på alla efterföljande bilder. - Valfritt: använd funktionen "Convolve" (kernelläge, i Process > Filters) för att minska bakgrunden.
OBS: Detta är valfritt och vanligtvis inte nödvändigt när du använder 5 m sektioner på grund av sektionernas tunnare karaktär. - Aktivera formbeskrivningarna och begränsa till tröskelalternativ på funktionen "Ställ in mått" (se till att dessa aktiveras genom analysen).
- I menyn "Justera" väljer du tröskelfunktionen och justerar tröskelnivån. Tröskelvärdena måste bibehållas för alla celler i samma prov.
- Försök att säkerställa adekvat visualisering av det mitokondriella nätverket, som visas i de representativa bilderna i den här artikeln, samtidigt som du kasserar bakgrundspixlar.
- Använd verktyget Analysera partiklar på fliken Analysera. Ställ in en lämplig storlek för att fånga mitokondrierna. I det här exemplet size: 25-Infinity, activate: Pixel units och select: Show: Masks kommandon användes för att visualisera resultatet. Fiji beräknar och visar antal, bildförhållande (AR) och andra formparametrar i en ny panel.
- Utför statistisk analys av data efter behov. I detta experiment användes t-testet för att analysera skillnaden i genomsnittligt bildförhållande (AR) och antal beräknat av Fiji mellan experimentgrupperna efter normalitetstestning med D'Agostino och Pearson normalitetstester.
Representative Results
För att säkerställa att lämpliga avbildnings- och analysbetingelser finns för in situ-utvärdering av mitokondriell morfologi i vävnad rekommenderas en in vitro-undersökning av mitokondriell morfologi som svar på en känd modulator av mitokondriell morfologi (avsnitt 1). Som ett exempel överuttrycktes SNCA genetiskt i SH-SY5Y-celler för att inducera förändringar i mitokondriell morfologi som tidigare beskrivits26. Andra förolämpningar som skulle kunna användas som en kontroll för att förvärra mitokondriernas morfologi skulle vara svält eller användning av mitokondriella aktivitetshämmare som MPP+. Cellerna transfekterades och färgades för α-synuklein (AS) för att separera SNCA+ (AS+) och SNCA- (AS-) celler. De färgades också med TOMM2027 för att visualisera det mitokondriella nätverket av celler. För att göra denna analys så lik som möjligt den av ett 5 μm vävnadssnitt analyserades ett konfokalplan i motsats till en maximal projektion av flera plan. Morfologisk analys av ett konfokalt plan av TOMM20 avslöjade att både det totala antalet mitokondrier och deras bildförhållande eller AR (som korrelerar med förlängningen av organellen) reducerades som svar på SNCA-överuttryck (Figur 1).
Immunfärgning utfördes för mitokondrieproteinet VDAC1 i 5 μm paraffinbäddade mushjärnsnitt från djur som injicerats med PFF enligt beskrivningen i protokollavsnittet ovan. Substantia nigra pars compacta (SNc) dopaminerga nervceller, som genomgår degeneration vid Parkinsons sjukdom, avslöjades genom samtidig immunfärgning med antityrosinhydroxylas (TH) och separerades regionalt från det ventrala tegmentala området och substantia nigra pars lateralis. Å andra sidan gjorde färgning av antifosfoser129-α-synuklein (pS129) det möjligt för oss att skilja celler som hyste pS129-lesioner från friska celler (pS129+ jämfört med pS129-). SNc-bilder av tre olika djur togs, och efterföljande bildanalys av VDAC1-färgning av TH-positiva neuroner avslöjade en minskning av både mitokondriellt antal och bildförhållande mellan neuroner som bär pS129-lesioner och neuroner som saknar dessa (Figur 2). Dessa resultat indikerar att den mitokondriella morfologin hos nervceller som hyser pS129-lesioner är nedsatt jämfört med celler som saknar pS129-lesioner.
Även om detta specifika experiment visar en minskning av AR, vilket belyser en minskning av förlängningen av mitokondrier tillsammans med en minskning av globala antal, vilket indikerar en försämring av mitokondriernas morfologi, bör tolkningen av data vara experimentberoende. Till exempel kan en minskning av AR och antal peka på en global minskning av mitokondrieinnehåll såväl som fragmentering, medan en minskning av AR men en ökning av globala antal skulle peka på en mitokondriell fragmenteringsfenotyp. Därför är det viktigt att tolka uppgifterna i samband med båda åtgärderna.
Figur 1: Mitokondriell morfologi i en SNCA-överuttryckande in vitro-modell . Samimmunfärgning för TOMM20 (grön), α-synuklein (AS, röd) och DAPI (blå) på SNCA-överuttryckande och icke-överuttryckande (AS+ respektive AS-) celler (A). Detalj av en AS-cell (B) och en AS+-cell (C). Svartvita bilder i panelerna (B) och (C) representerar maskerna för TOMM20-signalen efter tillämpning av Fiji-funktionen som beskrivs i avsnittet Protokoll. Denna mask möjliggör kvantifiering av formen på de resulterande strukturerna. Mitokondriella antal och Aspect Ratio (AR)-värden för AS- och AS+-celler (N = 25 celler per tillstånd) kvantifierades och representerades som individuella värden samt genomsnittliga ± SEM; **p-värde < 0,05 t-test (D). Normaliteten bedömdes genom D'Agostino- och Pearson-normalitetstesterna. Skalstreck: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mitokondriell morfologi påverkas i nervceller som hyser pS129-lesioner. Co-immunfärgning för TH (grön), VDAC1 (röd), fosfoS129-α-synuklein (magenta) och DAPI (blå) av SNc hos PFF-injicerade möss (A). Detaljen av en fosfoS129-α-synukleinnegativ (pS129-) dopaminerg neuron (B) och av en fosfoS129-α-synukleinpositiv (pS129+) dopaminerg neuron (C). Svartvita bilder i panelerna (B) och (C) representerar maskerna för TOMM20-signalen efter tillämpning av Fiji-funktionen som beskrivs i avsnittet Protokoll. Denna mask möjliggör kvantifiering av formen på de resulterande strukturerna. Negativa och positiva celler räknades i prover från tre olika djur, vilket illustreras av de olika färgerna på de individuella diagramvärdena (blått, grönt och orange). Mitokondriella räkningar och AR-kvantifiering av pS129- (N = 29) jämfört med pS129+ (N = 22) i dopaminerga neuroner representerades som medelvärde ± SEM såväl som individuella cellvärden; **p-värde < 0,05 t-test (D). Normaliteten bedömdes genom D'Agostino- och Pearson-normalitetstesterna. Skalstreck: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Sammantaget visar denna studie att immunfärgning i kombination med bildanalys är en tillförlitlig metod för att analysera mitokondriell morfologi. Faktum är att det gör det möjligt att kvantifiera antalet mitokondrier såväl som vissa morfologiska parametrar såsom bildförhållande i både cellkultur och vävnad. Antalet mitokondrier är direkt kopplat till den funktionella statusen hos provernas fissions- och fusionsmekanismer, medan AR-värdet är beroende av organellens förlängning. Denna metod kan vara särskilt värdefull för snabb utvärdering av mitokondriella abnormiteter i modeller av PD där förändrad mitokondriell morfologi, dynamik och funktioner är välkända patologiska mekanismer28,29. α-synuklein spelar också en relevant roll vid Parkinsons sjukdom: α-synuklein är faktiskt en av komponenterna i Lewykroppar, de cytoplasmatiska fibrillära aggregat som används för post-mortem-diagnos av PD-patienter30. Dessutom hittades mutationer i SNCA-genen hos patienter med både känd och sporadisk PD (granskad i31). Fosforylering av α-synuklein vid Ser129 har i stor utsträckning visat sig märka Lewykroppsliknande patologi, som uppstår efter PFF-förolämpning och framkallar olika toxiska effekter32,26.
Med hjälp av verktyget som presenteras här kunde vi detektera en minskning av mitokondriellt antal och AR-värden i närvaro av både överuttryckta och aggregerade α-synuklein (celler med α-synukleinfärgning respektive neuroner med fosfoSer129α-synukleinpositiva lesioner) jämfört med celler som saknar sådana lesioner (α-synuklein- och fosfoS129α-synukleinnegativa celler). Dessa resultat överensstämmer med tidigare rapporter som visar hur direkta interaktioner mellan α-synuklein-mitokondrier ger toxiska effekter på mitokondriell funktion och homeostas i PD26,33 34. Det rapporterades faktiskt att möss med α-synukleinmutationer uppvisar ökad mitokondriell DNA-skada35 och mitofagi 36,37. Dessutom beskrevs det att ökade nivåer av α-synuklein främjar mitokondriell fission/fragmentering, inducerar reaktiva syrearter i mitokondrier och dysreglerar mitokondriellt proteinuttryck i cellinjer och musmodeller som överuttrycker α-synuklein 26,38,39.
Det är viktigt att betona att detta verktyg i hög grad beror på de antikroppar som används för studien; Noggrann morfologisk utvärdering av den använda antikroppsfärgningen är absolut nödvändig för att detektera lämpligt subcellulärt fack. Eftersom denna teknik är baserad på 5 μm sektioner och därför kräver enstaka fokalplan för analys av mitokondriella strukturer, kommer frånvaron av en fenotyp inte att utesluta existensen av en fenotyp, eftersom det är möjligt att subtila skillnader i mitokondriell morfologi inte kan upptäckas med denna metod.
Även om detta arbete och andra tidigare har använt liknande metoder för att utvärdera mitokondriell morfologi in vivo40, finns det ett behov av att ett detaljerat protokoll görs tillgängligt för forskarsamhället för denna bedömning. Betydelsen av denna studie är att det är möjligt att tillämpa denna metod på olika in vivo sjukdomsmodeller för att bedöma mitokondriella morfologiska avvikelser och identifiera potentiell patologi, vilket så småningom kan underlätta screening av ledande föreningar för behandling av sådana sjukdomar. Även om denna analys för närvarande är begränsad till paraffininbäddad vävnad, är fördelen med metoden att den kan tillämpas på vilken sjukdomsmodell som helst efter terminal vävnadsinsamling, vilket gör den till ett mycket mångsidigt verktyg.
Disclosures
Vi vill inte rapportera några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma finansiärerna av denna studie, särskilt Ikerbasque, det spanska ministeriet för vetenskap och innovation, Michael J Fox Foundation, IBRO och Achucarro Basque Center for Neuroscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 G Hamilton syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 4/0 USP 45 cm suture | SSa90 pga | 32345n-36u | |
| Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse | Invitrogen | A21202; A21203 | green/red dye-Donkey anti-Mouse |
| Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit | Invitrogen | A21207 A31573 | red/far red dye-Donkey anti-Rabbit |
| AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | green dye-Donkey anti-Chicken |
| Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody | Abcam | ab51253 | |
| Anti-TOM 20 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-17764 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody | Abcam | ab76442 | |
| Anti-VDAC1 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-390996 | |
| Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) | Abcam | ab138501 | |
| Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) | Home-made | ||
| Disposable base mold for tissue embedding | Fisher | 22-363-553 | Plastic embedding boxes |
| D-MEM F12 | Gibco | A321331020 | |
| EVOS M7000 Imaging System | ThermoFisher Scientific | High-content automated fluorescence microscope | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| Flat optical bottom 96 well plates | Greiner | 675090 | |
| FluorSave Reagent | Millipore | 345789-20ML | Mounting reagent |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-024 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | PAP-pen |
| Lipofectamine and Plus Reagent | Invitrogen | 11668-019; 11514-015 | Transfection reagent and transfection adjuvant |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | ||
| Normal Donkey Serum | Gibco | PCN5000 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection medium |
| PCDNA4 plasmid (backbone) | Addgene | 41036 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| SH-SY5Y cells/well | ATCC | HTB-11 | |
| Xylene substitute | Labbox | 22L36504 | |
| Zeiss Axio Imager Apotome 2 | Carl Zeiss | Structured illumination fluorescence imaging system | |
| α-synuclein peptide | rpeptide | S-1010-2 |
References
- Yang, Y., Lu, B. Mitochondrial morphogenesis, distribution, and parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (9), 953-963 (2009).
- Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Hedrich, K., et al. type, and origin of Parkin mutations: Review and case studies. Movement Disorders. 19 (10), 1146-1157 (2004).
- Kahle, P. J., Haass, C. How does parkin ligate ubiquitin to Parkinson's disease. EMBO reports. 5 (7), 681-685 (2004).
- Dawson, T. M., Dawson, V. L. The role of parkin in familial and sporadic Parkinson's disease. Movement Disorders. 25, S32-S39 (2010).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The Roles of PINK1, Parkin, and Mitochondrial Fidelity in Parkinson's Disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Bonifati, V., et al. DJ-1(PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurological Sciences. 24 (3), 159-160 (2003).
- Chia, S. J., Tan, E. -K., Chao, Y. -X. Historical Perspective: Models of Parkinson's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2464 (2020).
- Wilson, D. M., Cookson, M. R., Den Bosch, L. V. an, Zetterberg, H., Holtzman, D. M., Dewachter, I.
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M.
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 22 (1), 123-144 (1999).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Okamoto, K., Shaw, J. M. Mitochondrial Morphology and Dynamics in Yeast and Multicellular Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 39 (1), 503-536 (2005).
- Malpartida, A. B., Williamson, M., Narendra, D. P., Wade-Martins, R., Ryan, B. J. Mitochondrial Dysfunction and Mitophagy in Parkinson's Disease: From Mechanism to Therapy. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 329-343 (2021).
- Zou, W., et al. Nanoscopic quantification of sub-mitochondrial morphology, mitophagy and mitochondrial dynamics in living cells derived from patients with mitochondrial diseases. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 136 (2021).
- Navaratnarajah, T., Anand, R., Reichert, A. S., Distelmaier, F. The relevance of mitochondrial morphology for human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 134, 105951 (2021).
- Zambon, F., et al. Cellular α-synuclein pathology is associated with bioenergetic dysfunction in Parkinson's iPSC-derived dopamine neurons. Human Molecular Genetics. 28 (12), 2001-2013 (2019).
- Cherubini, M., Lopez-Molina, L., Gines, S. Mitochondrial fission in Huntington's disease mouse striatum disrupts ER-mitochondria contacts leading to disturbances in Ca2+ efflux and Reactive Oxygen Species (ROS) homeostasis. Neurobiology of Disease. 136, 104741 (2020).
- Parihar, M. S., Parihar, A., Fujita, M., Hashimoto, M., Ghafourifar, P. Alpha-synuclein overexpression and aggregation exacerbates impairment of mitochondrial functions by augmenting oxidative stress in human neuroblastoma cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 2015-2024 (2009).
- Wiemerslage, L., Lee, D. Quantification of mitochondrial morphology in neurites of dopaminergic neurons using multiple parameters. Journal of Neuroscience Methods. 262, 56-65 (2016).
- Liu, Y. -T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Shoshan-Barmatz, V., Shteinfer-Kuzmine, A., Verma, A. VDAC1 at the intersection of cell metabolism, apoptosis, and diseases. Biomolecules. 10 (11), 1485 (2020).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein transmission initiates parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Ryan, B. J., et al. REST protects dopaminergic neurons from mitochondrial and α-synuclein oligomer pathology in an alpha synuclein overexpressing BAC-transgenic mouse model. The Journal of Neuroscience. 41 (16), 3731-3746 (2021).
- Yamamoto, H., et al. Dual role of the receptor Tom20 in specificity and efficiency of protein import into mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 91-96 (2011).
- Exner, N., Lutz, A. K., Haass, C., Winklhofer, K. F. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: molecular mechanisms and pathophysiological consequences. The EMBO Journal. 31 (14), 3038-3062 (2012).
- Grünewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American journal of pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Vázquez-Vélez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44 (1), 87-108 (2021).
- Mahul-Mellier, A. -L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply α-synuclein fibrillization, is one of the major drivers of neurodegeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (9), 4971-4982 (2020).
- Ganguly, U., et al. Interaction of α-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells: implications in the pathogenesis of Parkinson's disease. Biochemical Journal. 477 (6), 1109-1122 (2020).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Martin, L. J., et al. Parkinson's Disease α-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. The Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
- Choubey, V., et al. Mutant A53T α-Synuclein induces neuronal death by increasing mitochondrial autophagy. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10814-10824 (2011).
- Chen, L., Xie, Z., Turkson, S., Zhuang, X. A53T Human α-synuclein overexpression in transgenic mice induces pervasive mitochondria macroautophagy defects preceding dopamine neuron degeneration. The Journal of Neuroscience. 35 (3), 890-905 (2015).
- Kamp, F., et al. Inhibition of mitochondrial fusion by α-synuclein is rescued by PINK1, Parkin and DJ-1. The EMBO Journal. 29 (20), 3571-3589 (2010).
- Nakamura, K., et al. Direct membrane association drives mitochondrial fission by the parkinson disease-associated protein α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20710-20726 (2011).
- Park, J., et al. Abnormal mitochondria in a non-human primate model of MPTP-induced Parkinson's disease: Drp1 and CDK5/p25 signaling. Experimental Neurobiology. 28 (3), 414-424 (2019).
