Strømlinjeformet intravital bildebehandlingstilnærming for langsiktig overvåking av epitelvevsdynamikk på et invertert konfokalmikroskop

Summary

Protokollen presenterer et nytt verktøy for å forenkle intravital avbildning ved hjelp av invertert konfokalmikroskopi.

Abstract

Forståelse av normal og avvikende in vivo celleatferd er nødvendig for å utvikle kliniske intervensjoner for å hindre sykdomsinitiering og progresjon. Det er derfor viktig å optimalisere bildebehandlingsmetoder som letter observasjonen av celledynamikk in situ, hvor vevsstruktur og sammensetning forblir uforstyrret. Den epidermis er kroppens ytterste barriere, samt kilden til de mest utbredte menneskelige kreftformer, nemlig kutane hudkarsinomer. Tilgjengeligheten av hudvev gir en unik mulighet til å overvåke epitel- og dermale celleadferd hos intakte dyr ved bruk av ikke-invasiv intravital mikroskopi. Likevel har denne sofistikerte bildebehandlingsmetoden primært blitt oppnådd ved hjelp av stående multifotonmikroskoper, som representerer en betydelig barriere for oppføring for de fleste etterforskere. Denne studien presenterer en spesialdesignet, 3D-trykt mikroskopsceneinnsats egnet for bruk med inverterte konfokale mikroskoper, som strømlinjeformer den langsiktige intravitale avbildningen av ørehud i levende transgene mus. Vi tror at denne allsidige oppfinnelsen, som kan tilpasses for å passe til det inverterte mikroskopmerket og den valgte modellen og tilpasset bildet av flere organsystemer, vil vise seg å være uvurderlig for det større vitenskapelige forskningsmiljøet ved å forbedre tilgjengeligheten til intravital mikroskopi betydelig. Denne teknologiske utviklingen er avgjørende for å styrke vår forståelse av levende celledynamikk i normale og sykdomskontekster.

Introduction

Intravital mikroskopi er et kraftig verktøy som gjør det mulig å overvåke celleadferd i deres uforstyrrede in vivo-miljøer. Denne unike metoden har gitt viktig innsikt i den indre driften av komplekse pattedyrs organsystemer, inkludert lunge¹, hjerne², lever³, brystkjertel⁴, tarm⁵ og hud⁶. Videre har denne tilnærmingen avslørt celleadferdsendringer under tumorutvikling⁷, sårheling^8,9, betennelse¹⁰ og andre forskjellige patologier in situ. I denne studien fokuserer vi på å forbedre tilgjengeligheten til intravital mikroskopi for å avbilde levende epitel- og stromaldynamikk i intakt musehud. Forståelse av celleadferd i pattedyrhud er av høy klinisk betydning på grunn av den bemerkelsesverdige regenerative og tumorigene kapasiteten til dette vevet.

Intravital avbildning hos mus har primært blitt utført ved bruk av stående multifotonmikroskop på grunn av deres evne til å gi høyoppløselig avbildning på vevsdybder >100 μm^11,12. Ikke desto mindre mangler disse instrumentene arbeidshestens allsidighet og mer generelle tilgjengelighet av inverterte konfokale mikroskoper, som er mer brukervennlige og kostnadseffektive, gir muligheten til å avbilde dyrkede celler, krever ikke fullstendig mørke under bildeopptak, og er generelt tryggere, blant andre bemerkelsesverdige fordeler^13,14. I denne studien presenterer vi et nytt verktøy som betydelig forbedrer intravital bildetilgjengelighet ved å tilpasse denne tilnærmingen for inverterte konfokale mikroskoper.

Her presenterer vi en 3D-trykt tilpasset sceneinnsatsdesign som inneholder flere viktige funksjoner for å lette stabil, langsiktig intravital avbildning av museørehud på et invertert konfokalmikroskop (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5). Disse spesialiserte funksjonene inkluderer et forskjøvet objektivt hull som gjør at hele kroppen til en voksen mus kan ligge helt flatt under avbildning. Dette minimerer vibrasjonsforstyrrelsen av musens kroppsbevegelser på bildebehandling og eliminerer behovet for å administrere ketamin og xylazin for å dempe pusten, en praksis ofte kombinert med intravital avbildning⁶. I tillegg plasserer hjørnebraketter på innsatsen riktig en isofluran nesekegle for å justere seg med musens ansikt, en metalløreklemme immobiliserer museøret til en spesialbygd dekselskive, og en valgfri avtakbar biofeedback-varmeplate med lukket sløyfe ligger flush i innsatsen for å støtte musens kroppstemperatur under lange bildebehandlingsøkter. Den tilpassede coverslip-disken, som gir en flat overflate som er avgjørende for at musehodet og øret skal ligge flatt, ble generert i et maskinverksted ved å fjerne veggene i en generisk dekkslipholdig cellekulturfat. Bruken av en 40x silikonolje nedsenkingslinse (1,25 numerisk blenderåpning [N.A.], 0,3 mm arbeidsavstand) sammen med coverslip-disken og tilpasset sceneinnsats gir bilder med høy oppløsning >50 μm dypt inn i øredermis.

For å teste funksjonaliteten til denne nye inverterte mikroskopsceneinnsatsen, fanget vi z-stabler som spenner over alle epidermale epitellag over et 3-timers tidsforløp i øret til en levende transgen K14-H2B-mCherry¹⁵ voksen mus (epitelkjerner i denne muselinjen inneholder en rød fluorescerende etikett) (figur 6A-A‘). Vi fanget også z-stabler som spenner over flere fibroblastlag i huden dermis over et 3 timers tidsforløp i øret til en levende transgen Pdgfra-rtTA¹⁶; pTRE-H2B-GFP¹⁷ voksen mus (fibroblastkjerner i denne muselinjen inneholder en grønn fluorescerende etikett etter doksysyklininduksjon) (figur 6B-D‘). Våre høyoppløselige data viser konsistent stabilitet ved mangel på drift i x-, y- og z-planene, og viser dermed effektiviteten til dette nye intravitale bildeverktøyet for bruk på inverterte mikroskoper. Det er viktig at dimensjonene til denne 3D-printede sceneinnsatsen kan justeres, som beskrevet i tilleggsfil 1, tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3, for å passe til ethvert omvendt mikroskop, og plasseringen av objektivåpningen kan flyttes til alternative steder i innsatsen for å bedre passe til avbildning av en bestemt vevs- og/eller dyremodell av interesse. Denne oppfinnelsen kan dermed gi individuelle laboratorier, eller etterforskere med konfokal tilgang til kjernefasiliteter, mulighet til å tilpasse dette verktøyet for deres unike intravitale bildebehov, og dermed strømlinjeforme evalueringen av ulike in vivo cellebiologi.

Protocol

Denne undersøkelsen ble utført i samsvar med Emory University og Atlanta Veterans Affairs Medical Center retningslinjer for dyrepleie og bruk og er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Installere live imaging innsatsen på det inverterte mikroskopstadiet Konstruer innsatsen ved hjelp av STL-filer (tilleggsfil 1, tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3) som angir 3D-dimensjoner og utforming (se figur 1</str…

Representative Results

Riktig montering av live-bildeinnsatsen på et invertert konfokalmikroskop og passende orientering av en transgen mus på toppen av innsatsen valideres ved å anskaffe z-stabler av fluorescerende merket, levende ørevev over et tidsforløp ≥1 time med minimal bevis på drift i x-, y- og z-aksene. Bilder bør tas med jevne intervaller (intervalltiden vil avhenge av det biologiske spørsmålet, styrken til fluorescenssignalet, etc.) slik at celledynamikk og bildedrift kan spores over tid. Gjennom hele tidsforløpet avsl?…

Discussion

I denne studien presenterer vi et nytt verktøy som muliggjør stabil, langsiktig intravital avbildning av intakt musehudepitel på inverterte konfokale mikroskoper. Denne oppfinnelsen er laget av PLA, som er det vanligste og billigste 3D-utskrivbare materialet; alle interne 3D-utskriftskostnader for denne innsatsen utgjør < $ 5. De to separate innsatsstykkene (figur 1, tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2) kan enkelt settes sammen ved hjelp av settskruer (se <st…

Materials

3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging