Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop

Summary

Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug zur Vereinfachung der intravitalen Bildgebung mittels invertierter konfokaler Mikroskopie dar.

Abstract

Das Verständnis des normalen und aberranten Verhaltens von In-vivo-Zellen ist notwendig, um klinische Interventionen zu entwickeln, die den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit vereiteln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, bildgebende Verfahren zu optimieren, die die Beobachtung der Zelldynamik in situ ermöglichen, wo die Gewebestruktur und -zusammensetzung ungestört bleiben. Die Epidermis ist die äußerste Barriere des Körpers und die Quelle der häufigsten Krebserkrankungen des Menschen, nämlich des Hautkarzinoms. Die Zugänglichkeit von Hautgewebe bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Verhalten von Epithel- und Hautzellen bei intakten Tieren mit nicht-invasiver intravitaler Mikroskopie zu überwachen. Nichtsdestotrotz wurde dieser ausgeklügelte Bildgebungsansatz in erster Linie mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen erreicht, die für die meisten Forscher eine erhebliche Eintrittsbarriere darstellen. In dieser Studie wird ein speziell entwickelter, 3D-gedruckter Mikroskoptischeinsatz vorgestellt, der für die Verwendung mit inversen konfokalen Mikroskopen geeignet ist und die intravitale Langzeitbildgebung der Ohrhaut in lebenden transgenen Mäusen optimiert. Wir glauben, dass diese vielseitige Erfindung, die an die Marke und das Modell des inversen Mikroskops angepasst und an die Abbildung zusätzlicher Organsysteme angepasst werden kann, sich als unschätzbar wertvoll für die größere wissenschaftliche Forschungsgemeinschaft erweisen wird, indem sie die Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie erheblich verbessert. Dieser technologische Fortschritt ist entscheidend für unser Verständnis der Dynamik lebender Zellen in normalen und krankheitsbedingten Kontexten.

Introduction

Die intravitale Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Überwachung des Zellverhaltens in ihrer ungestörten In-vivo-Umgebung ermöglicht. Diese einzigartige Methode hat wichtige Einblicke in das Innenleben komplexer Organsysteme von Säugetieren geliefert, darunter Lunge¹, Gehirn², Leber³, Brustdrüse⁴, Darm⁵ und Haut⁶. Darüber hinaus hat dieser Ansatz Zellverhaltensänderungen während der Tumorentwicklung⁷, der Wundheilung^8,9, der Entzündung¹⁰ und anderer verschiedener Pathologien in situ aufgedeckt. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Verbesserung der Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie zur Abbildung von Live-Epithel- und Stromadynamik in intakter Maushaut. Das Verständnis des Zellverhaltens in der Haut von Säugetieren ist aufgrund der bemerkenswerten regenerativen und tumorigenen Fähigkeit dieses Gewebes von großer klinischer Bedeutung.

Die intravitale Bildgebung bei Mäusen wurde hauptsächlich mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen durchgeführt, da diese eine hochauflösende Bildgebung in Gewebetiefen >100 μm ermöglichen^11,12. Nichtsdestotrotz fehlt diesen Instrumenten die Vielseitigkeit und allgemeinere Zugänglichkeit von inversen konfokalen Mikroskopen, die benutzerfreundlicher und kostengünstiger sind, die Möglichkeit bieten, kultivierte Zellen abzubilden, bei der Bildaufnahme keine völlige Dunkelheit erfordern und im Allgemeinen sicherer sind, neben anderen bemerkenswerten Vorteilen^13,14. In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das die Zugänglichkeit der intravitalen Bildgebung erheblich verbessert, indem es diesen Ansatz für inverse konfokale Mikroskope adaptiert.

Hier präsentieren wir ein 3D-gedrucktes, kundenspezifisches Tischeinsatzdesign, das mehrere Schlüsselfunktionen enthält, um eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung der Ohrhaut von Mäusen auf einem inversen konfokalen Mikroskop zu ermöglichen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5). Zu diesen speziellen Merkmalen gehört ein versetztes Objektivloch, das es ermöglicht, dass der gesamte Körper einer erwachsenen Maus während der Bildgebung völlig flach liegt. Dies minimiert die Vibrationsstörung der Körperbewegungen von Mäusen bei der Bildgebung und eliminiert die Notwendigkeit, Ketamin und Xylazin zu verabreichen, um die Atmung zu dämpfen, eine Praxis, die oft mit intravitaler Bildgebung gekoppelt ist⁶. Darüber hinaus positionieren Eckklammern am Einsatz einen Isofluran-Nasenkonus korrekt, um sich an der Vorderseite der Maus auszurichten, ein Ohrclip aus Metall immobilisiert das Mausohr an einer speziell angefertigten Deckglasscheibe, und eine optionale abnehmbare Biofeedback-Heizplatte mit geschlossenem Regelkreis liegt bündig im Einsatz, um die Körpertemperatur der Maus bei langen Bildgebungssitzungen zu unterstützen. Die maßgeschneiderte Deckglasscheibe, die eine flache Oberfläche bietet, die für das flache Liegen des Mauskopfes und des Ohrs unerlässlich ist, wurde in einer Maschinenwerkstatt hergestellt, indem die Wände einer generischen Deckglasschale mit Zellkulturschalen entfernt wurden. Die Verwendung einer 40-fachen Silikonöl-Immersionslinse (1,25 numerische Apertur [N.A.], 0,3 mm Arbeitsabstand) in Verbindung mit der Deckglasscheibe und dem benutzerdefinierten Tischeinsatz liefert hochauflösende Bilder >50 μm tief in die Ohrdermis.

Um die Funktionalität dieses neuen inversen Mikroskoptischeinsatzes zu testen, haben wir Z-Stapel, die alle epidermalen Epithelschichten umfassen, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr einer lebenden transgenen K14-H2B-mCherry¹⁵ adulten Maus aufgenommen (Epithelkerne in dieser Mauslinie enthalten eine rot fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6A-A‘). Wir haben auch Z-Stapel aufgenommen, die sich über mehrere Fibroblastenschichten innerhalb der Hautdermis erstrecken, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr eines lebenden transgenen Pdgfra-rtTA¹⁶; pTRE-H2B-GFP¹⁷ adulte Maus (Fibroblastenkerne in dieser Mauslinie enthalten nach Doxycyclin-Induktion eine grün fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6B-D‘). Unsere hochauflösenden Daten zeigen eine gleichbleibende Stabilität durch keine Drift in der x-, y- und z-Ebene und belegen damit die Wirksamkeit dieses neuen intravitalen Bildgebungswerkzeugs für den Einsatz an inversen Mikroskopen. Wichtig ist, dass die Abmessungen dieses 3D-gedruckten Tischeinsatzes angepasst werden können, wie in Zusatzdatei 1, Zusatzdatei 2 und Zusatzdatei 3 beschrieben, um in jedes inverse Mikroskop zu passen, und die Positionierung der Objektivöffnung kann an alternative Stellen innerhalb des Einsatzes verschoben werden, um der Abbildung eines bestimmten Gewebe- und/oder Tiermodells von Interesse besser gerecht zu werden. Diese Erfindung kann somit einzelne Laboratorien oder Forscher mit konfokalem Zugang zu Kerneinrichtungen in die Lage versetzen, dieses Werkzeug an ihre einzigartigen intravitalen Bildgebungsanforderungen anzupassen und dadurch die Bewertung verschiedener In-vivo-Zellbiologie zu rationalisieren.

Protocol

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Emory University und des Atlanta Veterans Affairs Medical Center für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. 1. Einbau des Live-Imaging-Einsatzes auf den inversen Mikroskoptisch Erstellen Sie die Einfügung mithilfe von STL-Dateien (Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3), die die …

Representative Results

Die korrekte Montage des Live-Imaging-Einsatzes auf einem inversen konfokalen Mikroskop und die geeignete Ausrichtung einer transgenen Maus auf dem Einsatz wird durch die Erfassung von Z-Stapeln von fluoreszenzmarkiertem, lebendem Ohrgewebe über einen Zeitverlauf von ≥1 h mit minimalen Anzeichen einer Drift in der x-, y- und z-Achse validiert. Die Bilder sollten in gleichmäßigen Intervallen aufgenommen werden (die Intervallzeit hängt von der biologischen Fragestellung, der Stärke des Fluoreszenzsignals usw. ab), d…

Discussion

In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung von intakten Hautepithelien der Maus auf inversen konfokalen Mikroskopen ermöglicht. Diese Erfindung besteht aus PLA, dem gebräuchlichsten und kostengünstigsten 3D-druckbaren Material; Alle internen 3D-Druckkosten für diesen Einsatz belaufen sich auf 5 <$. Die beiden separaten Einlegeteile (Abbildung 1, Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) las…

Materials

3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging