Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı
Summary
Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.
Abstract
Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.
Introduction
İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer1, beyin2, karaciğer3, meme bezi4, bağırsak5 ve cilt6 dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi 8,9, inflamasyon 10 ve diğer çeşitli patolojiler sırasında hücre davranış değişikliklerini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, sağlam fare derisinde canlı epitelyal ve stromal dinamikleri görüntülemek için intravital mikroskopinin erişilebilirliğini artırmaya odaklandık. Memeli derisindeki hücre davranışlarını anlamak, bu dokunun olağanüstü rejeneratif ve tümörjenik kapasitesi nedeniyle yüksek klinik öneme sahiptir.
Farelerde intravital görüntüleme, doku derinliklerinde >100 μm11,12 yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yetenekleri nedeniyle öncelikle dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu cihazlar, daha kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olan, kültürlenmiş hücreleri görüntüleme yeteneği sağlayan, görüntü elde etme sırasında tam karanlık gerektirmeyen ve genellikle daha güvenli olan ters konfokal mikroskopların çok yönlülüğünden ve daha genel erişilebilirliğinden yoksundur13,14. Bu çalışmada, bu yaklaşımı ters konfokal mikroskoplar için uyarlayarak intravital görüntüleme erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran yeni bir araç sunuyoruz.
Burada, ters konfokal bir mikroskopta fare kulağı derisinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştırmak için birkaç temel özelliği içeren 3D baskılı özel bir sahne eki tasarımı sunuyoruz (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Bu özel özellikler, görüntüleme sırasında yetişkin bir farenin tüm gövdesinin tamamen düz durmasına izin veren bir ofset objektif deliği içerir. Bu, fare vücut hareketlerinin görüntüleme üzerindeki titreşimsel girişimini en aza indirir ve genellikle intravital görüntüleme ile birleştirilen bir uygulama olan solunumu azaltmak için ketamin ve ksilazin uygulama ihtiyacını ortadan kaldırır6. Ek olarak, kesici uçtaki köşe parantezleri, farenin yüzüyle hizalanacak şekilde bir izofluran burun konisini doğru şekilde konumlandırır, metal bir kulak klipsi, fare kulağını özel olarak oluşturulmuş bir lamel diskine sabitler ve isteğe bağlı çıkarılabilir kapalı döngü biofeedback ısı plakası, uzun görüntüleme oturumları sırasında fare vücut sıcaklığını desteklemek için ek parçanın içinde aynı hizada bulunur. Fare kafasının ve kulağının düz durması için gerekli olan düz bir yüzey sağlayan özel lamel diski, bir makine atölyesinde, genel bir lamel içeren hücre kültürü kabının duvarlarının kaldırılmasıyla üretildi. Lamel diski ve özel sahne eki ile birlikte 40x silikon yağına daldırma lensinin (1,25 sayısal açıklık [N.A.], 0,3 mm çalışma mesafesi) kullanılması, kulak dermisinin derinliklerinde >50 μm derinliğinde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.
Bu yeni ters çevrilmiş mikroskop aşaması ekinin işlevselliğini test etmek için, canlı bir transgenik K14-H2B-mCherry15 yetişkin farenin kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca tüm epidermal epitel katmanlarını kapsayan z-yığınlarını yakaladık (bu fare serisindeki epitel çekirdekleri kırmızı bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6A-A‘). Ayrıca, canlı bir transgenik Pdgfra-rtTA16’nın kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca cilt dermisi içindeki birkaç fibroblast tabakasını kapsayan z-yığınlarını yakaladık; pTRE-H2B-GFP17 yetişkin fare (bu fare serisindeki fibroblast çekirdekleri, doksisiklin indüksiyonunu takiben yeşil bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6B-D‘). Yüksek çözünürlüklü verilerimiz, x, y ve z düzlemlerinde sapma olmaması nedeniyle tutarlı bir kararlılık göstermekte ve böylece bu yeni intravital görüntüleme aracının ters mikroskoplarda kullanım için etkinliğini kanıtlamaktadır. Daha da önemlisi, bu 3D baskılı aşama ekinin boyutları, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3’te açıklandığı gibi, herhangi bir ters çevrilmiş mikroskoba uyacak şekilde ayarlanabilir ve objektif açıklığın konumu, ilgilenilen belirli bir doku ve/veya hayvan modelinin görüntülenmesine daha iyi uyması için ek içindeki alternatif konumlara taşınabilir. Bu buluş, böylece bireysel laboratuvarları veya çekirdek tesis konfokal erişimi olan araştırmacıları, bu aracı benzersiz intravital görüntüleme ihtiyaçlarına uyarlamak için güçlendirebilir ve böylece çeşitli in vivo hücre biyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA’dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K14-mCherry-H2B fareleri için Valentina Greco’ya teşekkür ederiz. Emory Üniversitesi Fizik Bölümü Makine Atölyesi’ne cam lamel diskleri ürettiği için minnettarız. Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı BLRD Hizmeti’nden LS’ye Kariyer Geliştirme Ödülü #IK2 BX005370, MJMR’ye NIH Ödülleri RF1-AG079269 ve R56-AG072473 ve MJMR’ye I3 Emory SOM/GT Hesaplama ve Veri Analizi Ödülü ile finanse edilmiştir.
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen, ., et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Multidimensional imaging of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt, ., et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. 암 연구학. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li, ., et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar, ., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
