Strømlinet intravital billeddannelsesmetode til langsigtet overvågning af epitelvævsdynamik på et inverteret konfokalmikroskop

Summary

Protokollen præsenterer et nyt værktøj til at forenkle intravital billeddannelse ved hjælp af omvendt konfokal mikroskopi.

Abstract

Forståelse af normal og afvigende in vivo-celleadfærd er nødvendig for at udvikle kliniske interventioner for at modvirke sygdomsinitiering og progression. Det er derfor afgørende at optimere billeddannelsesmetoder, der letter observationen af celledynamik in situ, hvor vævsstruktur og sammensætning forbliver uforstyrret. Den epidermis er kroppens yderste barriere, samt kilden til de mest udbredte menneskelige kræftformer, nemlig kutane hud carcinomer. Tilgængeligheden af hudvæv giver en unik mulighed for at overvåge epitel- og dermalcelleadfærd hos intakte dyr ved hjælp af ikke-invasiv intravital mikroskopi. Ikke desto mindre er denne sofistikerede billeddannelsesmetode primært opnået ved hjælp af opretstående multifotonmikroskoper, som udgør en betydelig adgangsbarriere for de fleste efterforskere. Denne undersøgelse præsenterer en specialdesignet, 3D-printet mikroskopindsats, der er egnet til brug med inverterede konfokale mikroskoper, hvilket strømliner den langsigtede intravitale billeddannelse af ørehud hos levende transgene mus. Vi mener, at denne alsidige opfindelse, som kan tilpasses til at passe til det omvendte mikroskopmærke og den valgte model og tilpasses til at afbilde yderligere organsystemer, vil vise sig uvurderlig for det større videnskabelige forskningssamfund ved væsentligt at forbedre tilgængeligheden af intravital mikroskopi. Dette teknologiske fremskridt er afgørende for at styrke vores forståelse af levende celledynamik i normale og sygdomssammenhænge.

Introduction

Intravital mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der tillader overvågning af celleadfærd i deres uforstyrrede in vivo-miljøer. Denne unikke metode har givet vigtig indsigt i de indre funktioner i komplekse pattedyrs organsystemer, herunder lunge¹, hjerne², lever³, brystkirtel⁴, tarm⁵ og hud⁶. Desuden har denne tilgang afsløret celleadfærdsændringer under tumorudvikling⁷, sårheling^8,9, betændelse¹⁰ og andre forskellige patologier in situ. I denne undersøgelse fokuserer vi på at forbedre tilgængeligheden af intravital mikroskopi til billede af levende epitel- og stromaldynamik i intakt musehud. Forståelse af celleadfærd i pattedyrs hud er af høj klinisk betydning på grund af den bemærkelsesværdige regenerative og tumorigene kapacitet af dette væv.

Intravital billeddannelse i mus er primært blevet udført ved hjælp af opretstående multifotonmikroskoper på grund af deres evne til at give billeddannelse i høj opløsning ved vævsdybder >100 μm^11,12. Ikke desto mindre mangler disse instrumenter arbejdshestens alsidighed og mere generelle tilgængelighed af inverterede konfokale mikroskoper, som er mere brugervenlige og omkostningseffektive, giver mulighed for at afbilde dyrkede celler, ikke kræver fuldstændig mørke under billedoptagelse og generelt er sikrere, blandt andre bemærkelsesværdige fordele^13,14. I denne undersøgelse præsenterer vi et nyt værktøj, der signifikant forbedrer intravital billeddannelse tilgængelighed ved at tilpasse denne tilgang til inverterede konfokale mikroskoper.

Her præsenterer vi et 3D-printet brugerdefineret sceneindsatsdesign, der indeholder flere nøglefunktioner for at lette stabil, langsigtet intravital billeddannelse af museørehud på et omvendt konfokalmikroskop (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5). Disse specialiserede funktioner omfatter et forskudt objektivt hul, der gør det muligt for hele kroppen af en voksen mus at ligge helt fladt under billeddannelse. Dette minimerer vibrationsinterferensen af musekroppens bevægelser ved billeddannelse og eliminerer behovet for at administrere ketamin og xylazin for at dæmpe vejrtrækningen, en praksis, der ofte kombineres med intravital billeddannelse⁶. Derudover placerer hjørnebeslag på indsatsen korrekt en isofluran næsekegle for at justere med musens overflade, en metaløreclips immobiliserer museøret til en specialbygget coverslip-disk, og en valgfri aftagelig lukket sløjfe biofeedback-varmeplade ligger flush inde i indsatsen for at understøtte musens kropstemperatur under lange billedbehandlingssessioner. Den brugerdefinerede coverslip-disk, som giver en flad overflade, der er afgørende for, at musens hoved og øre kan ligge fladt, blev genereret i et maskinværksted ved at fjerne væggene i en generisk coverslip-holdig cellekulturskål. Brugen af et 40x silikoneolienedsænkningsobjektiv (1,25 numerisk blænde [NA], 0,3 mm arbejdsafstand) sammen med coverslip-disken og brugerdefineret sceneindsats giver billeder i høj opløsning >50 μm dybt ind i øredermis.

For at teste funktionaliteten af denne nye inverterede mikroskopindsats, fangede vi z-stakke, der spænder over alle epidermale epitellag over et 3 timers tidsforløb i øret på en levende transgen K14-H2B-mCherry¹⁵ voksen mus (epitelkerner i denne muselinje indeholder en rød fluorescerende etiket) (figur 6A-A ‘). Vi fangede også z-stakke, der spænder over flere fibroblastlag i huddermis over et 3 timers tidsforløb i øret på en levende transgen Pdgfra-rtTA¹⁶; pTRE-H2B-GFP¹⁷ voksen mus (fibroblastkerner i denne muselinje indeholder en grøn fluorescerende etiket efter doxycyclininduktion) (figur 6B-D‘). Vores data i høj opløsning viser konstant stabilitet ved manglende drift i x-, y- og z-planerne, hvilket beviser effektiviteten af dette nye intravitale billeddannelsesværktøj til brug på inverterede mikroskoper. Det er vigtigt, at dimensionerne på denne 3D-printede trinindsats kan justeres, som beskrevet i Supplementary File 1, Supplementary File 2 og Supplementary File 3, så de passer til ethvert omvendt mikroskop, og placeringen af objektivåbningen kan flyttes til alternative steder i indsatsen for bedre at passe til billeddannelse af et bestemt væv og / eller dyremodel af interesse. Denne opfindelse kan således give individuelle laboratorier eller efterforskere med kernefacilitetskonfokal adgang mulighed for at tilpasse dette værktøj til deres unikke intravitale billeddannelsesbehov og derved strømline evalueringen af forskelligartet in vivo-cellebiologi.

Protocol

Denne forskning blev udført i overensstemmelse med Emory University og Atlanta Veterans Affairs Medical Center retningslinjer for dyrepleje og brug og er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Installation af live imaging insertet på det inverterede mikroskop trin Konstruer indsatsen ved hjælp af .stl-filer (supplerende fil 1, supplerende fil 2 og supplerende fil 3) med angivelse af 3D-dimensioner og design (se …

Representative Results

Korrekt samling af levende billedindsatsen på et omvendt konfokalmikroskop og passende orientering af en transgen mus oven på indsatsen valideres ved at erhverve z-stakke af fluorescerende mærket, levende ørevæv over et tidsforløb ≥1 time med minimal tegn på drift i x-, y- og z-akserne. Billeder skal tages med ensartede intervaller (intervaltid afhænger af det biologiske spørgsmål, styrken af fluorescenssignalet osv.), Så celledynamik og billeddrift kan spores over tid. Gennem hele tidsforløbet afslører ov…

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi et nyt værktøj, der letter stabil, langsigtet intravital billeddannelse af intakt musehudepitel på inverterede konfokale mikroskoper. Denne opfindelse er lavet af PLA, som er det mest almindelige og billige 3D-printbare materiale; alle interne 3D-printomkostninger for dette skær beløber sig til < $ 5. De to separate skærstykker (figur 1, supplerende fil 1 og supplerende fil 2) kan let samles ved hjælp af sætskrue…

Materials

3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging