Summary
単一の腫瘍の抗原を目標とするキメラ抗原の受容器(CAR)を表現するJurkatのセルによって量的な腫瘍の細胞の殺害を評価するプロトコル。このプロトコルは末梢血得られたT細胞の確認の前にCARの蝶番の構造の急速な最適化のためのスクリーニングのプラットホームとして使用することができる。
Abstract
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、腫瘍学の最前線にあります。CARは、ターゲティングドメイン(通常は一本鎖可変フラグメント、scFv)と、それに付随する鎖内リンカー、それに続くヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインで構成されています。鎖内リンカーおよびヒンジドメインの修飾は、CARを介した死滅に有意な影響を与える可能性があります。CARコンストラクトの各部分にはさまざまなオプションがあるため、多数の順列があります。CAR-T細胞の製造は時間と費用のかかるプロセスであり、多くのコンストラクトの作成とテストには多大な時間と材料の投資が必要です。このプロトコルは、Jurkatセル(CAR-J)のヒンジ最適化CARコンストラクトを迅速に評価するためのプラットフォームを記述しています。Jurkat細胞は、レンチウイルスの取り込み量が多い不死化T細胞株であり、効率的なCAR形質導入を可能にします。ここでは、蛍光イメージャーを用いてCAR-Jを迅速に評価し、PBMC由来T細胞の細胞溶解を確認するためのプラットフォームを紹介します。
Introduction
CAR-T細胞療法は、米国国立がん研究所が報告したように、2017年以降にFDAが承認した6つのCAR-T製品から明らかなように、血液悪性腫瘍において大きな有望性を示しています1。固形腫瘍を標的とする臨床試験には、多数のCAR-T細胞があります。新しいCAR標的を設計し、CARコンストラクトを最適化することは、CAR-T細胞の有効性に不可欠です。腫瘍関連抗原(TAA)を正確に標的とし、正常組織における低レベルのTAA発現を回避するには、各アプリケーションに最適なCARコンストラクトを選択することが不可欠です2。
CARコンストラクトは、主に5つのコンパートメントで構成されています:(1)腫瘍抗原を標的とする細胞外一本鎖可変フラグメント(scFv)ドメイン;(2)ヒンジドメイン;(3)膜貫通ドメイン;(4)細胞内細胞質T細胞共刺激ドメイン;(5)シグナル伝達ドメイン。これらのドメインのそれぞれを修飾することは、その標的細胞3と係合するCAR-T細胞の精度に影響を及ぼす。したがって、これらのCARコンストラクトの細胞毒性と交差反応性をin vitroで評価することは、in vivo実験に向けて進むための適切なコンストラクトを選択するために重要です。T細胞による細胞溶解を評価する現在の方法には、51Cr放出アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ、生物発光イメージングアッセイ、リアルタイムインピーダンスベースの細胞解析、および細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ4,5が含まれる。ここで説明する蛍光イメージングベースのプラットフォームは、生細胞と死細胞の数を同定し、T細胞による細胞溶解を評価する間接的な方法とは対照的に、T細胞細胞溶解の直接的な定量化です。
これは、MDA-MB-231トリプルネガティブ乳がん(TNBC)細胞に対する上皮成長因子受容体(EGFR)CARを発現するJurkat細胞の細胞毒性を評価するための、最小限の介入で、簡単で費用対効果が高く、迅速でハイスループットな技術であり、EGFR CRISPRはMDA-MB-231細胞をノックアウトします。Jurkat細胞は、不死化ヒトTリンパ球細胞6であり、T細胞の活性化とシグナル伝達のメカニズムの研究に広く用いられている7。さらに、Jurkat細胞は、複数の研究でin vitroCAR試験に使用されています8,9,10,11。Jurkat細胞はレンチウイルスによって容易に形質導入され、増殖が持続するため、このシステムはさまざまなEGFR CARコンストラクトのヒンジドメインを最適化するために活用されました。
このアッセイは、さまざまな腫瘍抗原を標的とする複数のCARコンストラクトのスクリーニングに使用でき、複数の接着腫瘍細胞株に対して、さまざまなエフェクターと腫瘍(E:T)の比率で使用できます。さらに、複数の時点を評価し、反復数を変更して、さまざまなCARコンストラクトの中から最適な殺傷を特定することができます。末梢血単核細胞(PBMC)由来のCD3 T細胞を用いて、最良のコンストラクトを確認する必要があります。この方法の開発の背後にある全体的な目標は、CARヒンジ形状をハイスループットで迅速に最適化し、形質導入効率の低さなどの障壁を克服し、PBMC由来のT細胞で確認することです。
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Protocol
注:すべての細胞培養作業は、白衣、手袋を着用し、標準的な無菌技術に従って、バイオセーフティキャビネットで行われます。
1. ジュルカト語を表現するCARの生成(CAR-J)
- Jurkat細胞を購入し、ATCCからE6-1のクローンを作る。T-75フラスコで1 x 106細胞を解凍し、T-75フラスコで培養します。10% FBSを添加したRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地をインキュベーター、37°C、5% CO2のインキュベーターで使用し、0.6 x 106細胞/mLの懸濁液に維持します。
- プレート:1 x 105 Jurkat 細胞/ウェル、組織培養処理、24ウェルプレート、レンチウイルス効率を高める4 μg/mLのポリブレンを含む500 μLのRPMI増殖培地にプレート。レーザーベースの蛍光検出ベンチトップセルアナライザーを使用して細胞をカウントします。ウェルの数は、評価するコンストラクトの数によって異なります。この例では、4 つのコンストラクトと形質変換されていないコントロールを使用します。CAR構成の設計を 表1に示します。
- 各CARコンストラクトのレンチウイルス/ウェルを10 μL添加します。CARコンストラクトの設計およびレンチウイルス産生は、前述のように行われた12。
- 翌日、1 mLの増殖RPMI培地を各ウェルに加え、インキュベーターで37°C、5%CO2で培養を続けます。
- 2日後(Jurkat形質導入後合計72時間)に細胞を採取し、それらをカウントします。
- 1 x 104 セルを流動に使用して、Jurkat 細胞での CAR 発現を確認します。簡単に説明すると、細胞をFACS染色液(FSS)で2回洗浄してから、CAR-Jを標的とする抗体で標識し、CAR陽性を検出するために使用したCAR陽性を4°Cの暗所で30分間標識します。 FSSで再度2回洗浄し、前述のようにフローサイトメーターに細胞を通します12。メーカーが推奨する抗体濃度を使用してください。
- Jurkat細胞は形質導入が容易で、ほとんどの場合、>90%のCAR発現を示します。共培養細胞毒性アッセイのかなり前にCAR-Jを作製し、後で使用するために凍結します。
2. CFSE標識腫瘍細胞の播種
注:MDA-MB-231(ATCC由来、HTB-26)細胞は共同研究者からの贈り物であり、EGFR KO MDA-MB-231は前述のように作成されました12。
- T-75フラスコで1 x 106 細胞を解凍し、T-75フラスコで培養します。MDA-MB-231腫瘍細胞およびCRISPR EGFR KO MDA-MB-231腫瘍細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した14 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で、5%CO2 を含む37°Cのインキュベーターで維持し、約70%コンフルエントになったら分割します。
- 通常の明視野顕微鏡で接着腫瘍細胞を観察し、約70%のコンフルエンスを確保します。
- 血清ピペットを使用してフラスコから増殖培地を取り除きます。3 mLのトリプシンをT75フラスコに加え、5%CO2 を含む37°Cのインキュベーターに3〜5分間入れて、フラスコから細胞を分離します。
- 等量(3 mL)の増殖培地を使用してトリプシンを中和します。細胞懸濁液を遠心チューブに集め、細胞を400 x g で4分間スピンダウンして細胞をペレットダウンします。
- ピペットを使用して上清を廃棄し、細胞を2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。セルカウンターを使用して細胞濃度を決定します。
- 8 x 105 細胞を別の 15 mL チューブに移し、PBS を添加して容量を 1 mL にします。
- カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE;ストック濃度5 μM)2 μLを各チューブに加え、1 mLのピペットでよく混合します。
- 細胞をCFSEとともに、37°Cのインキュベーター内で5%CO2で20分間インキュベートします。20分後にインキュベーターからチューブを取り出し、チューブに5 mLの成長培地を加えます。
- チューブを400 x g で4分間遠心分離し、CFSE標識細胞をペレットダウンします。ピペットを使用して上清を廃棄し、1 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁します。
- セルカウンターを使用して細胞濃度を再評価します。4 x 105 細胞を 25 mL の試薬リザーバーに移し、合計容量が 8 mL になるように培地を添加します。
- 100 μLの培地に5000個の腫瘍細胞/ウェルを播種するのに十分な容量を確保するには、マルチチャンネルピペットを使用してピペット操作できる容量が必要であり、ステップ1.7で数個の細胞の損失を補うために、10%〜20%の細胞と培地容量を余分に調製する必要があります。
- 5 mLの血清ピペットを使用して細胞懸濁液を完全に混合します。100μLのマルチチャンネルピペットを用いて、左半分の透明な平底黒色96ウェルプレートの各列に100μLの細胞懸濁液をピペットで移す。めっき戦略の例を 表2に示します。
- プレートの右半分に同様にEGFR KO細胞をピペットで固定します。プレート全体がプレートされたら、プレートを組織培養フードプラットフォーム上で前後左右にドラッグして、ウェル内の腫瘍細胞が均一に分布するようにします。
- 腫瘍細胞が付着するように、プレートを37°Cのインキュベーターで5%CO2 で4時間インキュベートします。
3. Jurkatsを発現するCARとCFSE標識腫瘍細胞の共培養
- 形質導入されていないJurkat細胞とCAR発現Jurkat細胞の数を用いて、各CAR-Jの4 x 105 細胞を25 mLのリザーバーに移します。DMEM増殖培地を添加し、総容量を2 mLにします。
- E:T が 4:1 の場合、2 x 104 CAR-J を 100 μL の培地に 1 ウェルあたり 2 x 10 4 CAR-J を、付着した腫瘍細胞を乱さないように、各ウェルの側面に沿って静かにマルチチャンネルピペットを使用して添加しました。
- マルチチャンネルピペットを使用して、腫瘍細胞およびJurkat細胞を含むウェルの側面にさらに100 μLの増殖培地を加えます。腫瘍グループのみに200μLの培地を投与し、すべてのウェルで合計300μLの培地を採取します。
- プレートをプラットフォームに沿って前後および左右にドラッグして、腫瘍細胞上のJurkat細胞が均一に分布するようにします。
- インキュベーターで37°C、5%CO2 で48時間共培養します。
4. イメージング用プレートの作製
- ヨウ化プロピジウム(PI)を低バックグラウンド蛍光培地に1 μg/mLで溶液を調製し、ウェルの数に基づいて、それぞれ100 μLの培地を得ます。
- 84ウェルの場合、PIを含む培地9 mLを調製します。ピペットを使用して培地を完全に混合します。
- Triton-Xを脱イオン水で希釈し、20%Triton-X溶液10 mLを作ります。共培養48時間後、プレートを1回反転させ、ペーパータオルを軽くたたいて、CAR-Jを含む上清を廃棄する。
- 次に、PIを含む上記で調製した培地100μL(ステップ4.2)を、接着した腫瘍細胞を乱さないように、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに静かに添加します。
- 20 μL の 20% Triton-X 溶液を、全死対照として機能する各腫瘍タイプの最初のウェルに加えます。
- プレートをインキュベーターに20分間置きます。蛍光イメージングサイトメーターを使用してプレートをイメージングします。データはコンピュータに保存され、後で分析できます。
5. 蛍光画像の解析
- 細胞の腫瘍のみのウェルの1つを使用して、緑色蛍光チャネルを設定します。
- ウェルマスクを98%に減らして、ウェルのエッジの細胞を除去します。エッジのシグナルは完全ではありません。
- 緑色蛍光CFSEチャネル上のCFSE標識腫瘍細胞を同定します。蛍光強度の閾値を変更して、ウェル上のすべての細胞をピックアップします。
- 最小セル径を 25 μm に設定して、CFSE チャネルで検出された破片を除去します。これは、分析する細胞の種類によって異なります。
- Separate Touching Objectsを有効にして、個々のセルが互いに接触しているときに識別します。
- 画像ディスプレイで CFSE を選択し、グラフィックオーバーレイを見て、システムによって選択されているものを把握します。
- CFSE標識細胞が適切にピックアップされたら、生細胞集団と死細胞集団を定義するゲートを設定します。
- CFSEラベル付きセルを選択すると、Y軸のカウントとX軸の平均PI強度のヒストグラムが生成されます。
- Triton-Xを添加したウェル(ステップ4.5)に基づいて、スプリッターを引いて、低PI染色細胞と高PI染色細胞を区別します。このウェルには、ほとんどの細胞が高PI染色領域にあるはずです。
注:PIは生細胞の基礎シグナルを示します。したがって、Triton-Xを添加すると、すべての細胞が死滅し、赤色蛍光チャネルで明るく染色されます。これにより、死細胞と生細胞を分離するためのゲートの描画が容易になります。 - セルを見やすくするために X 軸の値を調整します。次に、低PI染色細胞を生細胞として標識します。
- ライブセルを選択し、x軸に面積、y軸にカウントを持つ別のヒストグラムを設定します。
- 腫瘍のみを使用して別のスプリッターを描画し、細胞を捕捉し、破片を捕捉しません。Jurkatで処理された井戸は、CFSEで染色された破片を蓄積し始め、カウントから除去する必要があります。残りの非デブリは「ビッグセル」とラベル付けされています。
- プレート全体で分析を実行し、数値を含むスプレッドシートをエクスポートします。
- ビッグカウントをプロットして、CAR-Jへの曝露後にウェルに残っている生きたCFSE標識腫瘍細胞の数を特定します。一元配置分散分析を使用して統計量を決定します。
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Representative Results
CAR-J1 の E:T 比は 1:8 から 8:1 の範囲で 72 時間で評価され、TNBC MDA-MB-231 細胞の EGFR を標的としました。Jurkat細胞をポリブレンを含むCARレンチウイルスで形質導入し、ステップ2で説明したようにCAR-J細胞を作製しました。CAR-J1の細胞毒性は、E:T比が高いほど有意に増加し、1:8比で死滅に差はありませんでした(図1)。4:1 E:T で 72 時間にわたって 50% 以上の死滅が観察されました。このE:Tは、複数のCARコンストラクトの迅速な細胞毒性評価のために、所要時間を48時間に短縮して、その後の実験に使用しました。ヒンジドメインを修飾したCARコンストラクトを標的とするEGFRを設計しました(表1)。使用される4つの異なるヒンジは、ここで説明するように、長いIgG、IgG培地、短いIgG、およびCD8aです13。これらの3つのコンストラクトはJurkat細胞に発現し、CAR陽性は、ここで説明するように、フローサイトメトリー(図2A-D)によってフラグタグ付き細胞の割合を評価することによって決定されました12。形質導入されていないJurkat細胞をコントロール群として使用してCAR発現を決定し、ゲーティング戦略を図示します(図2E)。Jurkat細胞に発現したこれら4つのCARコンストラクトの細胞毒性を、MDA-MB-231細胞を発現するEGFR細胞およびCRISPR EGFR KO MDA-MB-231細胞に対して評価しました。抗原特異的死滅はすべてのコンストラクトで観察されましたが(図3A)、EGFR KO細胞に対しては有意な死滅は観察されず(図3B)、死滅はscFvのみを介して特異的に媒介されたことが示唆されました。形質転換されていないJurkat細胞による殺傷はありませんでした。また、CFSE標識された腫瘍細胞とPI染色された死核が重なり合って黄色に見える腫瘍死滅の代表的な画像も示されています(図4)。データは、グループごとに 6 つのテクニカル リプリケートを使用した 3 つの独立した実験を表しています。
このことは、PBMC由来のCD3 T細胞にこれらのCARコンストラクトを発現させることによってさらに確認された。CD3 T細胞ではCARの発現が低く、無菌フローソーティングによって濃縮されます(図5)。しかし、EGFR CARを含むCD8ヒンジの発現は認められなかった。したがって、IgG長、IgG培地、およびIgG短絡を含む他の3つのCARコンストラクトは、MDA-MB-231細胞に対する細胞傷害性の可能性について評価されました。IgGショートは、他の2つのコンストラクトと比較して細胞毒性の効力が最も低いため、同様の死滅傾向が見られます(図6)。IgG長細胞およびIgG中性CAR-T細胞の最良のコンストラクトを特定するために、TNBC腫瘍細胞への曝露の有無にかかわらず、それらの活性化を、前述のようにサイトカインの細胞内染色によって評価した12。MDA-MB-436はEGFRのレベルが低く、MDA-MB-468は13のTNBC細胞株12のパネルによるウェスタンブロットに基づく最も高いEGFRタンパク質発現を有する。IgG長鎖CAR-T細胞は、腫瘍細胞への曝露なしに、基礎活性化レベルが最も低く(TNFa、4-1BB)、細胞傷害性顆粒(パーフォリンおよびグランザイムB)の放出が低かった14(図7)。MDA-MB-468を発現する高EGFR細胞に曝露すると、IgG長鎖CAR-T細胞はTNFaおよび4-1BBに基づいて最も高い活性化を示しました。
図1:E:Tの範囲に沿ったEGFR CAR-J1細胞毒性評価。 CFSE標識MDA-MB-231腫瘍細胞を、CAR-J1を標的とする形質導入されていないJurkat細胞またはEGFRをE:T比1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1で播種し、エフェクター細胞が高いほど細胞毒性が増加しました。データは平均±標準偏差として表され、統計的有意性はスチューデントのt検定を使用して評価されました。1:8 E:T は有意ではなく、1:4 E:T は ***p<0.001、残りは ****p<0.0001 でした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2: in vitro 細胞毒性評価のためのEGFR CARジャーカット産生。 (A-D)CAR IgGロング、CAR IgGミディアム、CAR IgGショート、CAR CD8aの4つの異なるコンストラクトのほぼ90%〜100%CAR発現。(E)CAR陽性判定のためのゲーティング戦略:SSC-AとFSC-Aのプロットで除外された破片。FSC-H vs FSC-Aプロットで選択された単一セル。生存率色素DAPIネガティブゲーティングによって選択された生細胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:CAR-JとCFSEで標識された腫瘍細胞の共培養における細胞毒性評価。 (A)CFSE標識MDA MB 231細胞を4:1 E:T比でCAR-Jで48時間播種したところ、腫瘍細胞の殺傷においてさまざまな有効性が示されました。(B)CFSE標識CRISPR EGFR KO MDA MB 231細胞は、CAR-J細胞のいずれによっても死滅を経験しませんでした。データは平均±標準偏差で表され、統計的有意性は一元配置分散分析を使用して評価されました。**p<0.01;p<0.0001;NS: 重要ではありません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:共培養48時間後の画像の視覚的表現。 (A)CFSE(緑色)で標識された腫瘍細胞を有する腫瘍のみのグループ。(B)赤色細胞を死細胞とする非形質導入Jurkat細胞の追加、(C)矢印で示すように死滅腫瘍細胞(黄色)を示す緑と赤の重ね合わせ。黄色以外の緑色のセルの数が定量化されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:EGFR CD3 CAR-T細胞の濃縮。 (A-B)濃縮前のフラグ陽性細胞およびIgG陽性細胞の割合を決定することによって評価されたCAR発現、および(C)滅菌フローソートによる濃縮後の細胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:CD3 CAR-TとCFSE標識腫瘍細胞の共培養における細胞毒性評価。 CFSE 標識 MDA MB 231 細胞を 4:1 E:T 比で CAR-J で 48 時間プレーティングしたところ、腫瘍細胞の殺傷においてさまざまな有効性が示されました。データは平均±標準偏差で表され、統計的有意性は一元配置分散分析を使用して評価されました。**p<0.01;p<0.0001;NS: 重要ではありません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:EGFR CD3 CAR-T細胞の活性化。 CAR-T細胞を腫瘍細胞に曝露し、(A)TNFa、(B)4-1BB、(C)パーフォリン、および(D)グランザイムBの細胞内サイトカインレベルを評価しました。データは平均±SDとして表され、統計的有意性は一元配置分散分析*p<0.05を使用して評価されました。**p<0.01;**p<0.001;p<0.0001;NS: 重要ではありません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| いいえ。PA EGFR806 scFvの | Vh-VLリンカ | ヒンジ/スペーサー | TMの | 細胞 |
| CAR-IgGロング | ホイットロー(18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 AA) | CD4の | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG培地 | 瘭 | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28の | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG ショート | 瘭 | IgGショート(12 aa) | CD4の | 4-1BB / CD3z |
| 車CD8a | 瘭 | CD8(45単三) | CD8aの | 4-1BB / CD3z |
表1:CARコンストラクトの設計 略語:aa =アミノ酸;TM = 膜貫通。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| ある | トリトンエックス | MDA MB 231 のみ | トリトンエックス | MDA MB 231 EGFRのみKOのみ | ||||||||
| B | MB231 + モック 4:1 | MB231 EGFR KO +モック4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG ロング 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG ロング 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG ミディアム 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG ミディアム 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG ショート 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG ショート 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFRノックアウト+ EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
表2:めっき戦略の例。
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Discussion
本研究では、Jurkat細胞におけるCAR発現によって誘導される標的特異的な細胞溶解活性を効率的に評価するための迅速な方法を提案しました。すべてのCARコンストラクトは、同じscFvを持っていますが、ヒンジドメインと膜貫通ドメインが異なり、CAR-T細胞の効力に影響を与えることが示されています13。これらのCAR-Jによる非特異的死滅のさらなる評価は、抗原ノックアウト(KO)細胞で培養することによって行われました。これは、死滅が腫瘍抗原特異的であり、CAR-Jによる基礎活性化によるものではないことを示しています。E:T比の範囲の細胞毒性の可能性は、特定の時点で腫瘍細胞を排除するために必要なエフェクター細胞の数が最も少ないことを特定することで簡単に決定できます。また、同一または異なるがん種および正常細胞由来の複数の細胞株を用いて、これらのコンストラクトの特異性を評価することができる。CAR-Jプラットフォームによって同定された最も強力な候補は、PBMC由来のCD3 T細胞にCARを発現させ、同様の殺傷アッセイを実施し、抗原陽性および陰性の腫瘍細胞への曝露時の枯渇と活性化を評価することで、さらに特性評価することができます。
Jurkat細胞は、T細胞受容体(TCR)シグナル伝達経路が変化したCD4+細胞であることに留意しなければならない15。したがって、CARコンストラクトの細胞内シグナル伝達ドメインの最適化は、理想的にはCD3 T細胞16 で行われるべきであり、Jurkat細胞では最適に機能しない可能性がある。興味深いことに、CD4 T細胞は、IgGロングヒンジを持つCD4 CAR-T細胞を標的とするEGFRが頭蓋内腫瘍モデルでTNBC腫瘍を完全に根絶できるという以前の出版物で実証されているように、細胞毒性を示します12。さらに、CD4 CAR T細胞は、CD4とCD8 T細胞の混合物またはCD8 T細胞のみのGBM腫瘍モデルと比較して、長期的な効力とより良い死滅性を示し、効果的なCAR-T療法にとって臨床的に重要なT細胞サブセットとなっています17。
Jurkat細胞は活性化時にIL2を産生し、CD69をアップレギュレートするが、初代T細胞活性化のすべてのサイトカインを分泌するわけではない8,18。しかし、IL2およびCD69レベルの評価は、Jurkat細胞が活性化されることを知らせるものであり、このアプローチによって絶対腫瘍細胞数で定量化されている標的細胞の直接細胞溶解についてではありません。しかし、新規CAR分子の効果を完全に理解するためには、細胞毒性と活性化の評価が重要です。
この実験における共培養の期間は、使用するコンストラクトに基づいて変更することができます。腫瘍細胞のCFSE標識は、プレーティング後4日まで検出可能であることがわかりました。したがって、高いS/N比を達成するために、実験は72時間以内に行われました。CFSE強度は腫瘍細胞の分裂で減少するため、使用するCFSEの量と期間は、使用する腫瘍細胞ごとに変更する必要がある場合があります。これは一度に複数のコンストラクトを分析するハイスループット実験であるため、96ウェルプレート内の標的細胞の播種密度も最適化する必要があります。標的細胞は、アッセイ終了までに過剰にコンフルエントに増殖したり、競合的な増殖制限を受けたりしないように維持する必要がありますが、介入を最小限に抑えるために培地を変更する必要はありません。より大きなウェルプレートを使用して、より多くの細胞を収容し、実験の寿命を延ばすことができます。しかし、坑井の全体像を把握するために画像をつなぎ合わせる必要があり、各坑井を個別に処理する必要があるため、迅速かつ高いスループットが得られない可能性があります。
長期蛍光標識腫瘍細胞の別のアプローチは、緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)によるレンチウイルス形質導入によるものです。最適なS/N比を得るためには、高濃縮(ほぼ100%)の最も明るいコロニーを選択するために、適切なクローン選択を行う必要があります。生存率色素は、撮像装置内の蛍光検出器に基づいて適切に選択する必要があります。
バックグラウンド蛍光は使用するメディアに依存するため、画像取得中のシグナルの損失を防ぐためにチェックする必要があります。通常の培地には、励起すると大きな蛍光を発する成分が含まれています。低背景媒体19の使用が推奨される。PBSを使用しても構いませんが、撮影の設定によっては取得に約20分かかるため、画像取得時に細胞に影響を与える可能性があります。
このアッセイの限界の1つは、生存率色素を添加した後、同じ96ウェルプレートの複数の時点で画像を撮影できないことです。長期にわたるPIの添加効果は、この出版物では評価されていません。ただし、同じプレートを使用して、生きている細胞と死んだ/死にかけている標的細胞を一定期間にわたって検出できるのが理想的です。細胞が過度にコンフルエントになると、個々の細胞を分離することが困難になる場合があります。細胞単層の面積および蛍光強度は、20に記載したように、細胞の生存/死滅の割合を比較するために使用され得る。
CAR-T細胞による細胞溶解を検出するために使用される代替法は、死細胞と生細胞の絶対数を直接測定するのではなく、他の場所で詳細に説明されている間接的な方法によって効力を評価します4,5。したがって、この方法はエフェクター細胞の絶対的な説明を与え、イメージング機器の容量に応じて3種類の細胞の共培養にも使用できます。必要な細胞は非常に少なく(ウェルあたり5000個)、このアッセイを使用する大きな利点である時点を選択する自由とともに変化する可能性があります。懸濁液中および3次元スフェロイド培養中の標的細胞は、他の場所に記載されているように、エフェクター細胞および細胞溶解で決定された培養においても使用することができる21。さらに、このプラットフォームは、低分子や化合物の大規模なライブラリをスクリーニングして、最も効果的な分子を描写するために使用でき、複数の時点で複数の投与を行うことができます。
システムのスピードと柔軟性に加えて、最終的な利点はコストです。蛍光イメージング装置、プレート、試薬はすべて一般的で、特により洗練され、使い捨てプレートに貴金属を使用するデバイスと比較すると、手頃な価格で購入できます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
MDA-MB-231は、シェーン・ステックライン博士からの親切な贈り物でした。著者らは、この研究を実施するためにカンザス大学がんセンターから資金提供を受けていることを認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
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