مشبك ارتفاع السكر في الدم ومشبك سكر الدم في الفئران الواعية
Summary
يستخدم مشبك ارتفاع السكر في الدم لقياس إطلاق الأنسولين مع الحفاظ على تركيز أعلى من الجلوكوز في الدم. المشبك الخافض لسكر الدم هو لقياس إنتاج الجلوكوز الناجم عن الاستجابات المضادة للتنظيم. كلتا الطريقتين تستخدمان نفس الإجراء الجراحي. هنا ، نقدم تقنية المشبك لتقييم استقلاب الجلوكوز الجهازي.
Abstract
يحدث داء السكري (DM) بسبب عدم كفاية إفراز الأنسولين من خلايا β البنكرياس (النوع 1 DM) وحساسية الأنسولين في العضلات والكبد والأنسجة الدهنية (النوع 2 DM). يعالج حقن الأنسولين مرضى DM ولكنه يؤدي إلى نقص السكر في الدم كأثر جانبي. يتم إطلاق الكورتيزول والكاتيكولامينات لتنشيط إنتاج الجلوكوز من الكبد لاستعادة نقص السكر في الدم ، وتسمى الاستجابات التنظيمية المضادة (CRR). في أبحاث DM باستخدام نماذج القوارض ، يتم استخدام اختبارات تحمل الجلوكوز وحقن الجلوكوز 2-deoxy-glucose لقياس إطلاق الأنسولين و CRR ، على التوالي. ومع ذلك ، تتغير تركيزات الجلوكوز في الدم باستمرار أثناء التجارب ، مما يسبب صعوبات في تقييم صافي إفراز الأنسولين و CRR. توضح هذه المقالة طريقة يتم فيها الاحتفاظ بجلوكوز الدم عند 250 مجم / ديسيلتر أو 50 مجم / ديسيلتر في الفئران الواعية لمقارنة إفراز هرمونات الأنسولين و CRR ، على التوالي.
يتم زرع أنابيب البولي إيثيلين في الشريان السباتي للفئران والوريد الوداجي ، ويسمح للفئران بالتعافي من الجراحة. يتم توصيل أنبوب الوريد الوداجي بحقنة هاملتون بمضخة حقنة لتمكين ضخ الأنسولين أو الجلوكوز بمعدل ثابت ومتغير. أنبوب الشريان السباتي مخصص لجمع الدم. بالنسبة لمشبك ارتفاع السكر في الدم ، يتم غرس الجلوكوز بنسبة 30٪ في الوريد ، ويتم قياس مستويات الجلوكوز في الدم من الدم الشرياني كل 5 دقائق أو 10 دقائق. يتم زيادة معدل ضخ الجلوكوز بنسبة 30٪ حتى يصبح مستوى الجلوكوز في الدم 250 مجم / ديسيلتر. يتم جمع الدم لقياس تركيزات الأنسولين. بالنسبة لمشبك سكر الدم ، يتم حقن 10 mU / kg / min من الأنسولين مع 30٪ جلوكوز ، والذي يكون معدل ضخه متغيرا للحفاظ على 50 مجم / ديسيلتر من مستوى الجلوكوز في الدم. يتم جمع الدم لقياس الهرمونات المضادة للتنظيم عندما يصل كل من ضخ الجلوكوز والجلوكوز في الدم إلى حالة مستقرة. كل من المشابك ارتفاع السكر في الدم وسكر الدم لها نفس الإجراء الجراحي والإعدادات التجريبية. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة مفيدة للباحثين في استقلاب الجلوكوز الجهازي.
Introduction
الجلوكوز هو مصدر مهم للطاقة للخلايا ، ويمكن أن يؤدي نقص الجلوكوز إلى مجموعة متنوعة من الأعراض والمضاعفات. في حالة انخفاض الجلوكوز (نقص السكر في الدم ، بشكل عام أقل من 70 مجم / ديسيلتر في مستوى الجلوكوز في الدم الصائم ، ولكن لا ينبغي تحديده بقيمة واحدة1) ، تشمل الأعراض الأكثر شيوعا الضعف والارتباك والتعرق والصداع. يمكن أن يعطل أيضا وظيفة الدماغ ويزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدمويةوالوفيات 2. على العكس من ذلك ، فإن ارتفاع السكر في الدم هو حالة طبية يتجاوز فيها تركيز الجلوكوز في البلازما المستويات الطبيعية (بشكل عام > 126 مجم / ديسيلتر في مستوى الجلوكوز في الدم الصائم3). يمكن أن يحدث هذا في الأفراد المصابين بداء السكري الذين يعانون من عجز في إنتاج الأنسولين أو استخدامه. يمكن أن يؤدي ارتفاع السكر في الدم إلى الحماض الكيتوني السكري ، والذي يحدث عندما لا يستطيع الجسم استخدام الجلوكوز للحصول على الطاقة ولكن بدلا من ذلك يكسر الأحماض الدهنية للحصول على الوقود. حالة فرط الأسمولية ارتفاع السكر في الدم تزيد أيضا من معدل الوفيات4. يمكن أن يتسبب ارتفاع السكر في الدم على المدى الطويل في تلف الأوعية الدموية والأعصاب والأعضاء ، مما يؤدي إلى تطور العديد من المضاعفات المزمنة مثل أمراض القلب والأوعية الدموية واعتلال الشبكية وأمراض الكلى. وبالتالي ، يجب الحفاظ على تركيز الجلوكوز في الدم في نطاق ضيق بين 100 ملغ / ديسيلتر و 120 ملغ / ديسيلتر.
يتم تنظيم نسبة الجلوكوز في الدم من خلال التوازن بين مدخلات ومخرجات الجلوكوز في نموذج حجرة واحدة (الشكل 1 أ). يتضمن مدخل الجلوكوز الجلوكوز الممتص من الطعام وإنتاج الجلوكوز من الكبد والكلى والأمعاء الدقيقة. يشمل إنتاج الجلوكوز امتصاص الجلوكوز في الأنسجة والتخلص من الجلوكوز من الكلى. يتم تنظيم كل من كمية مدخلات الجلوكوز ومخرجاته بواسطة هرمونات الغدد الصماء. على سبيل المثال ، يتم إطلاق الجلوكاجون والكورتيكوستيرون والكاتيكولامينات ، والمعروفة باسم الهرمونات المضادة للتنظيم ، عندما تنخفض مستويات الجلوكوز في الدم5. أنها تحفز انهيار الجليكوجين وتوليف الجلوكوز ، وخاصة من الكبد. تعرف هذه العمليات باسم تحلل الجليكوجين وتكوين الجلوكوز ، على التوالي. يزيد ارتفاع السكر في الدم من إفراز الأنسولين من خلايا β البنكرياس ويحفز امتصاص الجلوكوز في العضلات والأنسجة الدهنية والقلب6،7،8،9. تزيد التمارين من امتصاص الجلوكوز المستقل عن الأنسولين10. يزيد الجهاز العصبي الودي من امتصاص الجلوكوز في العضلات والأنسجة الدهنية البنية 6,11. لقياس القدرة على تنظيم استقلاب الجلوكوز في الأنسجة المحيطية ، يستخدم الباحثون عادة اختبار تحمل الجلوكوز (GTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT) (الشكل 1B ، C). في GTT ، يجب مراعاة عاملين: إطلاق الأنسولين وحساسية الأنسولين (الشكل 1B). ومع ذلك ، يختلف منحنى تركيز الجلوكوز خلال اختبار 120 دقيقة في كل فأر ، مما قد يؤثر على كميات مختلفة من إفراز الهرمونات. في ITT ، يتم تنظيم نسبة الجلوكوز في الدم عن طريق كل من حساسية الأنسولين وإطلاق الهرمونات المضادة للتنظيم. لذلك ، من الصعب تحديد المعنى الدقيق لاستقلاب الجلوكوز ، وإطلاق الأنسولين ، وحساسية الأنسولين في GTT و ITT ، في الحالات التي تكون فيها مستويات الجلوكوز في الدم غير ثابتة.
للتغلب على هذه المشاكل ، من المستحسن الحفاظ على نسبة الجلوكوز في الدم عند مستوى ثابت (أو “المشبك”). في مشبك ارتفاع السكر في الدم ، يتم ضخ الجلوكوز في مجرى الدم لرفع مستويات الجلوكوز في الدم إلى مستوى معين ثم يتم الحفاظ عليه عند هذا المستوى لفترة من الزمن. يتم ضبط كمية الجلوكوز المملوءة بناء على قياسات مستويات الجلوكوز في الدم كل 5-10 دقائق للحفاظ على حالة مستقرة. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لفهم معلمات إفراز الأنسولين عند مستوى الجلوكوز المثبت. مشبك سكر الدم هو وسيلة للحفاظ على مستويات منخفضة من الجلوكوز في الدم عن طريق ضخ الأنسولين. يتم غرس الجلوكوز بمعدل متغير للحفاظ على مستوى معين من الجلوكوز في الدم. إذا لم يستطع الفأر التعافي من نقص السكر في الدم ، فيجب ضخ المزيد من الجلوكوز.
على الرغم من وجود العديد من المزايا لأداء مشابك ارتفاع السكر في الدم وسكر الدم ، إلا أن الإجراءات الجراحية والتجريبية تعتبر صعبة من الناحية الفنية. وبالتالي ، لم يتمكن سوى عدد قليل من المجموعات البحثية من القيام بها. كنا نهدف إلى وصف هذه الأساليب للباحثين الذين يعانون من قيود مالية وقوى عاملة لبدء هذه التجارب بميزانية أقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموضحة هنا هي طريقة بسيطة يمكن القيام بها باستخدام أطراف الماصة والمحاقن وغيرها من العناصر الموجودة في المختبرات العادية. على الرغم من أن الباحثين قد يحتاجون إلى شراء أنابيب ومضخات إضافية ، إلا أن المعدات باهظة الثمن ليست ضرورية. وبالتالي ، فإن بروتوكول القسطرة والمشبك هذا أسهل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المبادرة الرائدة للباحثين الشباب المتميزين (من MEXT) ؛ (أ) منحة معونة للبحث العلمي (ب) (رقم المنحة JP21H02352)؛ الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED-RPIME، رقم المنحة JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); مؤسسة أوهارا التذكارية ؛ مؤسسة أستيلاس للبحوث في الاضطرابات الأيضية. مؤسسة سوزوكين التذكارية ، ومؤسسة أكياما لعلوم الحياة ، ومؤسسة ناريشيج لأبحاث علم الأعصاب. كما نشكر الدكتورة نور فريهان أصغر على تحرير مسودة هذه المخطوطة.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
References
- Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
- Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
- . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
- Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
- Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
- Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
- Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
- Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
- Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
- Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
- Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
- Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
- Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
- Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
- Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
- Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
- Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
- Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
- Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
- Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
- Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
- Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
- Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
- TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).
