Гипергликемический зажим и гипогликемический зажим у мышей в сознании
Summary
Гипергликемический зажим используется для измерения высвобождения инсулина при поддержании более высокой концентрации глюкозы в крови. Гипогликемический зажим предназначен для измерения выработки глюкозы, индуцированной контррегуляторными реакциями. В обоих методах используется одна и та же хирургическая процедура. Здесь мы представляем метод зажимов для оценки системного метаболизма глюкозы.
Abstract
Сахарный диабет (СД) обусловлен недостаточным выделением инсулина из β-клеток поджелудочной железы (СД 1 типа) и чувствительностью к инсулину в мышцах, печени и жировых тканях (СД 2 типа). Инъекции инсулина лечат пациентов с СД, но в качестве побочного эффекта приводят к гипогликемии. Кортизол и катехоламины высвобождаются, чтобы активировать выработку глюкозы из печени для восстановления гипогликемии, называемой контррегуляторной реакцией (CRR). В исследованиях СД на моделях грызунов для измерения высвобождения инсулина и CRR используют глюкозотолерантные тесты и инъекции 2-дезоксиглюкозы соответственно. Тем не менее, концентрация глюкозы в крови постоянно изменяется во время экспериментов, что вызывает трудности в оценке чистого высвобождения инсулина и CRR. В этой статье описывается метод, при котором уровень глюкозы в крови поддерживается на уровне 250 мг/дл или 50 мг/дл у мышей, находящихся в сознании, для сравнения высвобождения гормонов инсулина и CRR соответственно.
Полиэтиленовые трубки имплантируются в сонную артерию и яремную вену мышей, и мышам дают возможность восстановиться после операции. Трубка для яремной вены соединена со шприцем Hamilton с помощью шприцевого насоса для обеспечения инфузии инсулина или глюкозы с постоянной и переменной скоростью. Трубка сонной артерии предназначена для забора крови. При гипергликемическом зажиме в вену вводится 30% глюкозы, а уровень глюкозы в крови измеряется из артериальной крови каждые 5 минут или 10 минут. Скорость инфузии 30% глюкозы увеличивают до тех пор, пока уровень глюкозы в крови не станет 250 мг/дл. Кровь собирается для измерения концентрации инсулина. При гипогликемическом зажиме инсулин в дозе 10 мЕд/кг/мин вводят вместе с 30% глюкозой, скорость инфузии которой варьируется для поддержания уровня глюкозы в крови 50 мг/дл. Кровь собирается для измерения контррегуляторных гормонов, когда инфузия глюкозы и глюкоза в крови достигают стабильного состояния. Как гипергликемические, так и гипогликемические зажимы имеют одинаковую хирургическую процедуру и экспериментальные установки. Таким образом, данный метод полезен для исследователей системного метаболизма глюкозы.
Introduction
Глюкоза является важным источником энергии для клеток, и недостаток глюкозы может привести к различным симптомам и осложнениям. В случае низкого уровня глюкозы (гипогликемия, как правило, менее 70 мг/дл уровня глюкозы в крови натощак, но не должна определяться по одному значению1) наиболее распространенными симптомами являются слабость, спутанность сознания, потливость и головная боль. Он также может нарушить церебральную функцию и увеличить риск сердечно-сосудистых событий и смертности2. И наоборот, гипергликемия — это заболевание, при котором концентрация глюкозы в плазме превышает нормальный уровень (обычно > 126 мг/дл при уровне глюкозыв крови натощак 3). Это может произойти у людей с диабетом, у которых наблюдается дефицит в выработке или использовании инсулина. Гипергликемия может привести к диабетическому кетоацидозу, который возникает, когда организм не может использовать глюкозу для получения энергии, а вместо этого расщепляет жирные кислоты в качестве топлива. Гипергликемическое гиперосмолярное состояние также увеличивает смертность4. Длительная гипергликемия может вызвать повреждение кровеносных сосудов, нервов и органов, что приводит к развитию ряда хронических осложнений, таких как сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатии и заболевания почек. Таким образом, концентрация глюкозы в крови должна поддерживаться в узком диапазоне от 100 мг/дл до 120 мг/дл.
Уровень глюкозы в крови регулируется балансом между входом и выходом глюкозы в однокамерной модели (рис. 1А). Поступление глюкозы включает абсорбированную глюкозу из пищи и выработку глюкозы печенью, почками и тонким кишечником. Выброс глюкозы включает в себя поглощение глюкозы в тканях и выведение глюкозы из почек. Как количество входящей, так и выходящей глюкозы регулируется эндокринными гормонами. Например, глюкагон, кортикостерон и катехоламины, известные как контррегуляторные гормоны, высвобождаютсяпри снижении уровня глюкозы в крови. Они стимулируют расщепление гликогена и синтез глюкозы, главным образом из печени; Эти процессы известны как гликогенолиз и глюконеогенез соответственно. Гипергликемия увеличивает высвобождение инсулина из β-клеток поджелудочной железы и стимулирует поглощение глюкозы в мышцах, жировых тканях и сердце 6,7,8,9. Физические упражнения увеличивают инсулиннезависимое поглощение глюкозы10. Симпатическая нервная система увеличивает поглощение глюкозы в мышцах и бурой жировой ткани 6,11. Для измерения способности регулировать метаболизм глюкозы в периферических тканях исследователи обычно используют тест на толерантность к глюкозе (GTT) и тест на толерантность к инсулину (ITT) (рис. 1B, C). При ГТТ необходимо учитывать два фактора: высвобождение инсулина и чувствительность к инсулину (рис. 1Б). Тем не менее, кривая концентрации глюкозы во время 120-минутного теста различна у каждой мыши, что может влиять на разное количество высвобождения гормонов. При ИТТ уровень глюкозы в крови регулируется как чувствительностью к инсулину, так и высвобождением контррегуляторных гормонов. Таким образом, трудно определить точное значение метаболизма глюкозы, высвобождения инсулина и чувствительности к инсулину при ГТТ и ИТТ в ситуациях, когда уровень глюкозы в крови не постоянен.
Для преодоления этих проблем желательно поддерживать уровень глюкозы в крови на постоянном уровне (или «зажим»). При гипергликемическом зажиме глюкоза вводится в кровоток, чтобы поднять уровень глюкозы в крови до определенного уровня, а затем поддерживается на этом уровне в течение определенного периода времени. Количество вводимой глюкозы корректируется на основе измерений уровня глюкозы в крови каждые 5-10 минут для поддержания устойчивого состояния. Эта методика особенно полезна для понимания параметров секреции инсулина при зажатом уровне глюкозы. Гипогликемический зажим – это метод поддержания низкого уровня глюкозы в крови путем введения инсулина. Глюкоза вводится с переменной скоростью для поддержания определенного уровня глюкозы в крови. Если мышь не может оправиться от гипогликемии, следует ввести больше глюкозы.
Несмотря на то, что выполнение гипергликемических и гипогликемических зажимов имеет много преимуществ, хирургические и экспериментальные процедуры считаются технически сложными. Таким образом, немногие исследовательские группы смогли сделать это. Мы стремились описать эти методы для исследователей с финансовыми и трудовыми ограничениями, чтобы начать эти эксперименты с меньшим бюджетом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь, прост, и его можно использовать с помощью наконечников пипеток, шприцев и других предметов, которые можно найти в обычных лабораториях. Несмотря на то, что исследователям может потребоваться приобрести дополнительные трубки и насосы, дорогостоящее оборудование …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ведущей инициативой для отличных молодых исследователей (MEXT); грант в поддержку научных исследований (B) (номер гранта JP21H02352); Японское агентство по медицинским исследованиям и разработкам (AMED-RPIME, номер гранта JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); Мемориальный фонд Уэхара; Фонд исследований метаболических нарушений Астелласа; Мемориальный фонд Судзукен, Фонд наук о жизни Акиямы и Фонд исследований в области нейробиологии Нарисигэ. Мы также благодарим Нура Фарехана Асгара, доктора философии, за редактирование черновика этой рукописи.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
References
- Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
- Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
- . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
- Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
- Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
- Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
- Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
- Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
- Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
- Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
- Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
- Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
- Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
- Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
- Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
- Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
- Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
- Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
- Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
- Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
- Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
- Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
- Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
- TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).
