의식이 있는 쥐의 고혈당 클램프 및 저혈당 클램프
Summary
고혈당 클램프는 더 높은 혈당 농도를 유지하면서 인슐린 방출을 측정하는 데 사용됩니다. 저혈당 클램프는 역조절 반응에 의해 유도된 포도당 생성을 측정하기 위한 것입니다. 두 방법 모두 동일한 수술 절차를 사용합니다. 여기에서는 전신 포도당 대사를 평가하기 위한 클램프 기술을 제시합니다.
Abstract
진성 당뇨병(DM)은 췌장 β세포의 인슐린 분비 부족(1형 DM)과 근육, 간, 지방 조직의 인슐린 민감성(2형 DM)으로 인해 발생합니다. 인슐린 주사는 DM 환자를 치료하지만 부작용으로 저혈당증을 유발합니다. 코르티솔과 카테콜아민은 간에서 포도당 생산을 활성화하여 저혈당을 회복하기 위해 분비되는데, 이를 역조절 반응(CRR)이라고 합니다. 설치류 모델을 이용한 DM 연구에서는 인슐린 방출과 CRR을 측정하기 위해 각각 포도당 내성 검사와 2-데옥시-포도당 주사를 사용합니다. 그러나 실험 중에 혈당 농도가 지속적으로 변하여 순 인슐린 분비와 CRR을 평가하는 데 어려움이 있습니다. 이 글에서는 의식이 있는 쥐의 혈당을 250mg/dL 또는 50mg/dL로 유지하여 각각 인슐린과 CRR 호르몬의 분비를 비교하는 방법을 설명합니다.
폴리에틸렌 튜브를 생쥐의 경동맥과 경정맥에 이식하고 생쥐가 수술에서 회복할 수 있도록 합니다. 경정맥 튜브는 주사기 펌프가 있는 해밀턴 주사기에 연결되어 일정하고 다양한 속도로 인슐린 또는 포도당을 주입할 수 있습니다. 경동맥 튜브는 혈액 수집을 위한 것입니다. 고혈당 클램프의 경우 30%의 포도당을 정맥에 주입하고 5분 또는 10분마다 동맥혈에서 혈당 수치를 측정합니다. 혈당 수치가 250mg/dL이 될 때까지 30% 포도당의 주입 속도가 증가합니다. 인슐린 농도를 측정하기 위해 혈액을 채취합니다. 저혈당 클램프의 경우 10mU/kg/min 인슐린을 30% 포도당과 함께 주입하며, 주입 속도는 50mg/dL의 혈당 수준을 유지하기 위해 가변적입니다. 포도당 주입과 혈당이 모두 정상 상태에 도달했을 때 역조절 호르몬을 측정하기 위해 혈액을 수집합니다. 고혈당 클램프와 저혈당 클램프는 모두 동일한 수술 절차와 실험 설정을 가지고 있습니다. 따라서 이 방법은 전신 포도당 대사 연구자에게 유용합니다.
Introduction
포도당은 세포의 중요한 에너지원이며, 포도당이 부족하면 다양한 증상과 합병증이 발생할 수 있습니다. 저혈당(저혈당, 일반적으로 공복 혈당 수치가 70mg/dL 미만이지만단일 값으로 결정되어서는 안 됨1)의 경우 가장 흔한 증상으로는 쇠약, 혼란, 발한, 두통 등이 있습니다. 또한 대뇌 기능을 방해하고 심혈관 질환 및 사망 위험을 증가시킬 수 있다2. 반대로, 고혈당증은 혈장 포도당 농도가 정상 수준(일반적으로 공복 혈당 수치3에서 > 126mg/dL)을 초과하는 의학적 상태입니다. 이는 인슐린 생산 또는 활용에 결핍이 있는 당뇨병 환자에서 발생할 수 있습니다. 고혈당증은 당뇨병성 케톤산증으로 이어질 수 있는데, 이는 신체가 포도당을 에너지로 사용하지 못하고 대신 지방산을 분해하여 연료로 사용할 때 발생합니다. 고혈당 고삼투압 상태도 사망률을 증가시킨다4. 장기적인 고혈당증은 혈관, 신경 및 장기에 손상을 일으켜 심혈관 질환, 망막병증 및 신장 질환과 같은 여러 만성 합병증의 발병으로 이어질 수 있습니다. 따라서 혈당 농도는 100mg/dL에서 120mg/dL 사이의 좁은 범위로 유지되어야 합니다.
혈당은 1구획 모델에서 포도당 입력과 출력 사이의 균형에 의해 조절됩니다(그림 1A). 포도당 입력에는 음식에서 흡수되는 포도당과 간, 신장 및 소장에서 포도당 생성이 포함됩니다. 포도당 출력은 조직의 포도당 흡수와 신장의 포도당 처리로 구성됩니다. 포도당의 투입량과 출력량은 모두 내분비 호르몬에 의해 조절됩니다. 예를 들어, 글루카곤, 코르티코스테론, 카테콜아민은 혈당 수치가 감소할 때 분비된다5. 그들은 주로 간에서 글리코겐의 분해와 포도당의 합성을 자극합니다. 이러한 과정은 각각 glycogenlysis 및 gluconeogenesis로 알려져 있습니다. 고혈당증은 췌장 β세포에서 인슐린 분비를 증가시키고 근육, 지방 조직 및 심장의 포도당 흡수를 자극한다 6,7,8,9. 운동은 인슐린과 무관한 포도당 흡수를 증가시킨다10. 교감 신경계는 근육과 갈색 지방 조직의 포도당 흡수를 증가시킵니다 6,11. 말초 조직의 포도당 대사를 조절하는 능력을 측정하기 위해 연구자들은 일반적으로 포도당 내성 검사(GTT)와 인슐린 내성 검사(ITT)를 사용합니다(그림 1B,C). GTT에서는 인슐린 분비와 인슐린 감수성이라는 두 가지 요소를 고려해야 합니다(그림 1B). 그러나 120분 테스트 중 포도당 농도 곡선은 마우스마다 다르며, 이는 호르몬 방출량에 따라 다를 수 있습니다. ITT에서 혈당은 인슐린 감수성과 역조절 호르몬의 방출에 의해 조절됩니다. 따라서 혈당 수치가 일정하지 않은 상황에서 GTT 및 ITT에서 포도당 대사, 인슐린 방출 및 인슐린 감수성의 정확한 의미를 결정하기 어렵습니다.
이러한 문제를 극복하려면 혈당을 일정한 수준(또는 “클램프”)으로 유지하는 것이 바람직합니다. 고혈당 클램프에서는 포도당을 혈류에 주입하여 혈당 수치를 특정 수준으로 올린 다음 일정 기간 동안 해당 수준을 유지합니다. 주입된 포도당의 양은 안정된 상태를 유지하기 위해 5-10분마다 혈당 수치를 측정하여 조정됩니다. 이 기술은 클램핑된 포도당 수준에서 인슐린 분비의 매개변수를 이해하는 데 특히 유용합니다. 저혈당 클램프는 인슐린을 주입하여 낮은 혈당 수치를 유지하는 방법입니다. 포도당은 특정 혈당 수치를 유지하기 위해 다양한 비율로 주입됩니다. 쥐가 저혈당에서 회복할 수 없으면 더 많은 포도당을 주입해야 합니다.
고혈당 및 저혈당 클램프를 수행하는 데에는 많은 이점이 있지만 수술 및 실험 절차는 기술적으로 어려운 것으로 간주됩니다. 따라서 이를 수행할 수 있는 연구 그룹은 거의 없습니다. 우리는 재정 및 인력 제약이 있는 연구자들이 더 적은 예산으로 이러한 실험을 시작할 수 있도록 이러한 방법을 설명하는 것을 목표로 했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 피펫 팁, 주사기 및 일반 실험실에서 볼 수 있는 기타 품목으로 수행할 수 있는 간단한 방법입니다. 연구원이 추가 튜브와 펌프를 구입해야 할 수도 있지만 값비싼 장비는 필요하지 않습니다. 따라서, 이러한 카테터 삽입 및 클램프 프로토콜은 이전 보고에 비해 시작하기가 더 쉽다(12,13,14).
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 우수한 젊은 연구자를 위한 선도 이니셔티브(Leading Initiative for Excellent Young Researchers, 문부과학성)의 지원을 받았습니다. 과학 연구 보조금 (B) (보조금 번호 JP21H02352); 일본 의료연구개발기구(AMED-RPIME, 허가 번호 JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); 우에하라 기념 재단; 대사 장애 연구를 위한 아스텔라스 재단; 스즈켄 기념 재단, 아키야마 생명 과학 재단, 나리시게 신경 과학 연구 재단. 또한 이 원고의 초안을 편집해 주신 Nur Farehan Asgar 박사님께도 감사드립니다.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
References
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