Bilinçli Farelerde Hiperglisemik Kelepçe ve Hipoglisemik Kelepçe
Summary
Daha yüksek kan şekeri konsantrasyonu ile insülin salınımını ölçmek için bir hiperglisemik kelepçe kullanılır. Hipoglisemik bir kelepçe, karşı düzenleyici yanıtların neden olduğu glikoz üretimini ölçmek içindir. Her iki yöntemde de aynı cerrahi prosedür kullanılır. Burada, sistemik glukoz metabolizmasını değerlendirmek için bir klemp tekniği sunuyoruz.
Abstract
Diabetes mellitus (DM), pankreas β hücrelerinden yetersiz insülin salınımı (Tip1 DM) ve kas, karaciğer ve yağ dokularında insülin duyarlılığı (Tip2 DM) nedeniyle oluşur. İnsülin enjeksiyonu DM hastalarını tedavi eder, ancak yan etki olarak hipoglisemiye yol açar. Kortizol ve katekolaminler, karşı düzenleyici yanıtlar (CRR) adı verilen hipoglisemiyi iyileştirmek için karaciğerden glikoz üretimini aktive etmek için salınır. Kemirgen modelleri kullanılarak yapılan DM araştırmalarında, insülin salınımını ve CRR’yi ölçmek için sırasıyla glukoz tolerans testleri ve 2-deoksi-glukoz enjeksiyonu kullanılmıştır. Bununla birlikte, kan şekeri konsantrasyonları deneyler sırasında sürekli olarak değişir ve bu da net insülin salınımını ve CRR’yi değerlendirmede zorluklara neden olur. Bu makale, insülin ve CRR hormonlarının salınımını karşılaştırmak için bilinçli farelerde sırasıyla kan şekerinin 250 mg/dL veya 50 mg/dL’de tutulduğu bir yöntemi açıklamaktadır.
Polietilen tüp, farelerin karotis arterine ve juguler venine implante edilir ve farelerin ameliyattan sonra iyileşmesine izin verilir. Juguler ven tüpü, sabit ve değişken bir oranda insülin veya glikoz infüzyonunu sağlamak için bir şırınga pompası ile bir Hamilton şırıngasına bağlanır. Karotis arter tüpü kan toplama içindir. Hiperglisemik klemp için damar içine %30 glikoz verilir ve her 5 dakikada bir veya 10 dakikada bir arteriyel kandan kan şekeri seviyeleri ölçülür. Kan şekeri seviyesi 250 mg/dL olana kadar %30 glukoz infüzyon hızı arttırılır. İnsülin konsantrasyonlarını ölçmek için kan alınır. Hipoglisemik klemp için, 10 mU / kg / dak insülin, infüzyon hızı 50 mg / dL kan şekeri seviyesini korumak için değişken olan% 30 glikoz ile birlikte infüze edilir. Hem glikoz infüzyonu hem de kan şekeri sabit bir duruma ulaştığında karşı düzenleyici hormonları ölçmek için kan toplanır. Hem hiperglisemik hem de hipoglisemik klempler aynı cerrahi prosedüre ve deney düzeneklerine sahiptir. Bu nedenle, bu yöntem sistemik glikoz metabolizması araştırmacıları için yararlıdır.
Introduction
Glikoz, hücreler için önemli bir enerji kaynağıdır ve glikoz eksikliği çeşitli semptomlara ve komplikasyonlara yol açabilir. Düşük glikoz durumunda (hipoglisemi, açlık kan şekeri seviyesinde genellikle 70 mg/dL’den az, ancak tek bir değer1 ile belirlenmemelidir), en yaygın semptomlar arasında halsizlik, kafa karışıklığı, terleme ve baş ağrısı bulunur. Ayrıca serebral fonksiyonu bozabilir ve kardiyovasküler olay ve mortalite riskini artırabilir2. Tersine, hiperglisemi, plazma glukoz konsantrasyonunun normal seviyeleri aştığı tıbbi bir durumdur (genellikle açlık kan şekeri seviyesi3’te 126 mg / dL’>). Bu, insülin üretiminde veya kullanımında bir eksiklik olan diyabetli bireylerde ortaya çıkabilir. Hiperglisemi, vücut enerji için glikoz kullanamadığında, bunun yerine yakıt için yağ asitlerini parçaladığında ortaya çıkan diyabetik ketoasidoza yol açabilir. Hiperglisemik hiperosmolar durum da mortaliteyi artırır4. Uzun süreli hiperglisemi kan damarlarına, sinirlere ve organlara zarar vererek kardiyovasküler hastalık, retinopatiler ve böbrek hastalıkları gibi çeşitli kronik komplikasyonların gelişmesine yol açabilir. Bu nedenle, kan şekeri konsantrasyonu 100 mg/dL ile 120 mg/dL arasında dar bir aralıkta tutulmalıdır.
Kan şekeri, tek bölmeli bir modelde glikoz giriş ve çıkışı arasındaki denge tarafından düzenlenir (Şekil 1A). Glikoz girişi, gıdalardan emilen glikozu ve karaciğer, böbrekler ve ince bağırsaktan glikoz üretimini içerir. Glikoz çıkışı, dokularda glikoz alımını ve böbreklerden glikoz atılımını içerir. Hem glikoz giriş hem de çıkış miktarı endokrin hormonları tarafından düzenlenir. Örneğin, karşı düzenleyici hormonlar olarak bilinen glukagon, kortikosteron ve katekolaminler, kan şekeri seviyeleri düştüğündesalınır 5. Glikojenin parçalanmasını ve esas olarak karaciğerden glikoz sentezini uyarır; Bu süreçler sırasıyla glikojenoliz ve glukoneogenez olarak bilinir. Hiperglisemi, pankreas β hücrelerinden insülin salınımını artırır ve kaslarda, yağ dokularında ve kalpte glikoz alımını uyarır 6,7,8,9. Egzersiz, insülinden bağımsız glikoz alımını artırır10. Sempatik sinir sistemi, kaslarda ve kahverengi yağ dokusunda glikoz alımını artırır 6,11. Periferik dokularda glukoz metabolizmasını düzenleme yeteneğini ölçmek için, araştırmacılar tipik olarak glukoz tolerans testini (GTT) ve insülin tolerans testini (ITT) kullanırlar (Şekil 1B, C). GTT’de iki faktör göz önünde bulundurulmalıdır: insülin salınımı ve insülin duyarlılığı (Şekil 1B). Bununla birlikte, 120 dakikalık test sırasında glikoz konsantrasyon eğrisi her farede farklıdır ve bu da farklı miktarlarda hormon salınımını etkileyebilir. ITT’de kan şekeri hem insülin duyarlılığı hem de karşı düzenleyici hormonların salınımı ile düzenlenir. Bu nedenle, kan şekeri seviyelerinin sabit olmadığı durumlarda, GTT ve ITT’de glikoz metabolizmasının, insülin salınımının ve insülin duyarlılığının kesin anlamını belirlemek zordur.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, kan şekerini sabit bir seviyede (veya “kelepçe”) tutmak arzu edilir. Hiperglisemik kıskaçta, kan şekeri seviyelerini belirli bir seviyeye yükseltmek için kan dolaşımına glikoz verilir ve daha sonra bir süre bu seviyede tutulur. İnfüzyon glikoz miktarı, sabit bir durumu korumak için her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerinin ölçümlerine göre ayarlanır. Bu teknik, klemplenmiş bir glikoz seviyesinde insülin sekresyonunun parametrelerini anlamak için özellikle yararlıdır. Hipoglisemik kelepçe, insülin infüze ederek düşük kan şekeri seviyelerini korumak için kullanılan bir yöntemdir. Glikoz, belirli bir kan şekeri seviyesini korumak için değişken bir oranda infüze edilir. Fare hipoglisemiden kurtulamazsa, daha fazla glikoz infüze edilmelidir.
Hiperglisemik ve hipoglisemik klemplerin uygulanmasının birçok avantajı olmasına rağmen, cerrahi ve deneysel prosedürler teknik olarak zor kabul edilir. Bu nedenle, az sayıda araştırma grubu bunları yapabilmiştir. Finansal ve işgücü kısıtı olan araştırmacıların bu deneyleri daha düşük bir bütçeyle başlatmaları için bu yöntemleri tanımlamayı amaçladık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntem, pipet uçları, şırıngalar ve sıradan laboratuvarlarda bulunan diğer öğelerle yapılabilecek basit bir yöntemdir. Araştırmacıların ek tüpler ve pompalar satın almaları gerekebilse de, pahalı ekipmanlara gerek yoktur. Bu nedenle, bu kateterizasyon ve klemp protokolünün başlatılması önceki raporlaragöre daha kolaydır 12,13,14.
Kelepçe tekniği 1970 ci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Mükemmel Genç Araştırmacılar için Lider Girişim (MEXT’ten) tarafından desteklenmiştir; Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (B) (Hibe Numarası JP21H02352); Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED-RPIME, Hibe Numarası JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h999901); Uehara Memorial Vakfı; Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı; Suzuken Memorial Vakfı, Akiyama Yaşam Bilimleri Vakfı ve Narishige Sinirbilim Araştırma Vakfı. Ayrıca, bu makalenin bir taslağını düzenlediği için Dr. Nur Farehan Asgar’a teşekkür ederiz.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
References
- Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
- Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
- . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
- Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
- Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
- Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
- Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
- Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
- Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
- Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
- Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
- Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
- Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
- Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
- Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
- Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
- Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
- Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
- Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
- Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
- Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
- Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
- Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
- TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).
