Summary
Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).
Abstract
As proteínas histonas são altamente abundantes e conservadas entre os eucariotos e desempenham um grande papel na regulação gênica como resultado de estruturas conhecidas como modificações pós-traducionais (MPTs). Identificar a posição e a natureza de cada PTM ou padrão de PTMs em referência a fatores externos ou genéticos permite que essa informação seja estatisticamente correlacionada com respostas biológicas, como transcrição, replicação ou reparo de DNA. No presente trabalho, um protocolo analítico de alto rendimento para a detecção de PTMs de histonas a partir de amostras biológicas é descrito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massas por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) permite a separação e atribuição de PTM das modificações biologicamente mais relevantes em uma única análise. A abordagem descrita aproveita os recentes desenvolvimentos na aquisição de dados dependentes (DDA) usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade, seguida por fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. Os PTMs Histone são atribuídos com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.
Introduction
Em células eucarióticas, o DNA é empacotado como cromatina em unidades funcionais chamadas nucleossomos. Essas unidades são compostas por um octâmero de quatro histonas de núcleo (duas de H2A, H2B, H3 e H4)1,2,3,4. As histonas estão entre as proteínas mais abundantes e altamente conservadas em eucariotos, as quais são as grandes responsáveis pela regulação gênica5. As modificações pós-traducionais de histona (MPTs) desempenham um grande papel na regulação da dinâmica da cromatina e rigger vários processos biológicos, como transcrição, replicação e reparo do DNA6. As MPT ocorrem principalmente na superfície acessível das regiões N-terminais das histonas que estão em contato com o DNA 3,7. Entretanto, modificações na cauda e no núcleo influenciam a estrutura da cromatina, alterando as interações internucleossomas e recrutando proteínas específicas 3,8.
Um desafio atual durante a proteômica baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) é a potencial co-eluição de analitos de interesse. No caso das análises dependentes de dados (DDA), isso se traduz na perda potencial de vários íons precursores durante o processo de aquisição de MS/MS9. Os instrumentos Time-of-flight (ToF) adquirem espectros em frequência muito alta 9,10 (até dezenas de kHz)11; isso os torna capazes de escanear rapidamente os íons precursores totais dentro de uma amostra complexa (MS1), prometendo sensibilidade ótima e taxas de sequenciamento MS/MS (até 100 Hz)9 e tornando-os ideais para análise de amostras biológicas10. No entanto, a sensibilidade disponível nessas altas taxas de exame é limitada pela taxa MS/MS9. A adição de espectrometria de mobilidade iônica aprisionada (TIMS) em combinação com um espectrômetro de massa ortogonal quadrupolo time-of-flight (qToF) foi usada para mitigar essas limitações. No TIMS, todos os íons precursores são acumulados em tandem e eluídos em função de sua mobilidade, em vez de selecionar massas precursoras únicas com um quadrupolo9. A acumulação paralela-fragmentação seriada (PASEF) permite centenas de eventos MS/MS por segundo sem qualquer perda de sensibilidade9.
O objetivo principal deste trabalho foi mostrar os desenvolvimentos recentes da DDA usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade, seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão (DDIC). Os PTMs Histone foram atribuídos com confiança com base em seus tempos de retenção (RTs), mobilidades e padrões de fragmentação.
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Protocol
NOTA: As amostras de histona foram extraídas usando um método adaptado de Bhanu et al (2020)12.
1. Preparação da amostra
- Colheita de células cultivadas
- Quando as células são 80% confluentes, certifique-se de que são viáveis usando a exclusão de azul de tripano.
NOTA: Uma linhagem celular HeLa S3 foi usada para esses experimentos, mas este método pode ser aplicado a qualquer célula cultivada. - Aspirar o meio e, em seguida, aplicar 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x em cada placa.
- Agite a(s) placa(s) para enxaguar todos os meios residuais, aspirar PBS e aplicar 5 mL de 1x PBS.
- Separe suavemente as células da placa raspando-as com um elevador de células descartável.
- Transfira cada suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
- Granular as células centrifugando a 800 x g por 5 min.
- Aspirar o PBS da pastilha celular.
- Prossiga para a extração de histonas.
NOTA: Congele rapidamente o pellet da pilha em azoto líquido se não puder ser processado imediatamente. Conservar os pellets a -80 °C até que esteja pronto para prosseguir.
- Quando as células são 80% confluentes, certifique-se de que são viáveis usando a exclusão de azul de tripano.
- Extração de histona
- Estimar o volume de cada pastilha celular e marcar o menisco com um marcador permanente.
- Preparar tampão de isolamento nuclear suficiente (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 e 250 mM sacarose) para todas as amostras. Alternativamente, se muitas amostras precisarem ser processadas ao longo do tempo, faça o tampão a granel e armazene a 2-8 °C por até 6 meses, ou alíquota e congele a -15 °C a -25 °C indefinidamente, descongelando apenas a quantidade necessária para cada extração.
Observação : o buffer deve permanecer limpo durante o armazenamento. Se o buffer assumir uma aparência turva ou anormal a qualquer momento, descarte e prepare um novo buffer. - Preparar 50 vezes o volume das células pellets de tampão de lavagem e adicionar inibidores da seguinte forma (aproximadamente 10 mL de tampão de lavagem por 2 amostras).
- Para preparar 10 mL de tampão de lavagem, misturar 10 mL de NIB, 30 μL de cloridrato de fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenosulfonilo 200 mM [AEBSF], 10 μL de ditiotreitol 1 M [TDT], 20 μL de microcistina 5 μM, 20 μL de butirato de sódio 5 M.
- Remover 1/5 do tampão de lavagem para preparar o tampão de lise (1/5 volume do tampão de lavagem, alternativa NP-40 ou NP-40 a 0,3%).
NOTA: Não use Triton-X 100 em vez de NP-40 ou NP-40 alternativa, pois pode ser muito abrasivo para certos tipos de células. - Lave bem o pellet de células suspendendo-o em 5 colunas de tampão de lavagem e centrifugando a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Conclua esta etapa duas vezes, aspirando e descartando o sobrenadante entre as lavagens.
- Certifique-se de que o volume do pellet da célula ainda esteja marcado com um marcador permanente. Ressuspender em 10 volumes de tampão de lise.
- Pipeta-misture bem cada pellet para ressuspender e, em seguida, incubar por 15 min no gelo.
- Após 15 min, centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
- Aspirar e descartar o sobrenadante.
NOTA: O pellet deve reduzir para ≤ 1/2 o tamanho original do pellet (conforme indicado pela linha do marcador). Se o pellet não tiver reduzido o suficiente, repita o procedimento de lise e inclua uma etapa de homogeneização suave usando um pilão para abrir as células. - Quando a lise estiver completa, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão de lavagem e, em seguida, centrifugue a 800 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar e descartar o sobrenadante, em seguida, repita a etapa de lavagem mais uma vez para remover todos os vestígios de NP-40.
NOTA: Neste ponto, o pellet consiste em cromatina, que contém histonas. - Ressuspender o pellet em 5 volumes (do tamanho original do pellet celular) de 0,4 N H2SO4.
- Incubar por 2 h em uma câmara fria ou geladeira usando um agitador.
- Após 2 h, centrifugar a(s) amostra(s) a 3400 x g durante 5 min a 4 °C. Não descarte o sobrenadante.
- Transfira o sobrenadante para novos tubos e aumente o ácido tricloroacético (TCA) a 100% do volume do conteúdo (a concentração final de TCA será de aproximadamente 20%).
- Inverta suavemente o tubo e observe que a solução límpida e incolor fica branca e/ou turva, indicando precipitação de proteína.
NOTA: Para soluções com baixas concentrações de histonas, a precipitação de proteínas pode não ser imediatamente perceptível, mas o precipitado deve ser visível após a incubação noturna. - Incubar sem perturbação durante a noite (12-18 h) a 4 °C para precipitar completamente as proteínas de histonas.
- No dia seguinte, centrifugar a 3400 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar as laterais do tubo com a ponta da pipeta. Nesta fase, as histonas são depositadas principalmente como um filme ao redor das laterais do(s) tubo(s).
- Adicionar 500 μL de acetona gelada + 0,1% HCl (acetona ácida) a cada tubo, utilizando uma pipeta de vidro Pasteur, e inverter suavemente o(s) tubo(s) várias vezes. Arrume as amostras em ordem (1, 2, 3, etc.) ao fazer isso, pois qualquer acetona errante pode remover as marcas nos tubos. Centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C e decantar suavemente o sobrenadante.
- Repita esta etapa de enxágue com 500 μL de acetona 100% gelada, também com uma pipeta de vidro Pasteur. Centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C e decantar suavemente o sobrenadante.
- Deixe os tubos abertos para secar à temperatura ambiente até que a acetona restante tenha evaporado.
- Quando estiver seco, adicionar 100 μL de água de grau de espectrometria de massa (MS) a cada tubo. Use esta gota para esfregar todos os lados do recipiente para ressuspender todo o filme de histona. Faça isso pipetando a gota na lateral do tubo e girando-a enquanto pipeta para cima e para baixo ou dispensando metade dos 100 μL e usando a ponta para mexer tudo ao redor. Uma combinação de ambos os métodos funciona melhor. As histonas são facilmente solúveis em água e estarão na solução.
- Depois de ressuspender todas as amostras, se houver algum sólido branco remanescente, sonicar em um banho à temperatura ambiente por 5 min.
- Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Transfira a solução límpida para tubos frescos. Descarte qualquer pellet insolúvel restante.
- Execute um SDS-PAGE em condições de redução para verificar se a extração está limpa.
NOTA: Os géis podem ser executados usando qualquer concentração apropriada de poliacrilamida, desde que possa diferenciar proteínas na faixa de 10-20 kDa. Consulte a Tabela de Materiais para os géis utilizados neste protocolo. - Realizar um ensaio de concentração de proteína (ou seja, Bradford ou BCA) para determinar a concentração total de proteína.
- Derivatização química (propionilação) dos resíduos de lisina
- Transferir 20 μg de histonas (determinadas pelo ensaio de proteínas) para um tubo limpo. Secar esta amostra até <5 μL usando um concentrador a vácuo e, em seguida, ressuspender usando 20 μL de bicarbonato de amônio 100 mM (NH4CO3) (~1 μg/μL solução). Ajuste o pH para ~8 usando hidróxido de amônio, se necessário.
CUIDADO: Não use hidróxido de amônio (NH4OH) para ressuspender, apenas para ajustar o pH se necessário. Caso contrário, as proteínas irão desnaturar e precipitar.
NOTA: Para verificar o pH com perda mínima de amostra, use uma ponta de pipeta para mergulhar na amostra e passar em uma tira de pH. Este procedimento de ensaio será útil ao longo das restantes etapas de preparação da amostra. - Preparar o reagente de propionilação adicionando anidrido propiónico à acetonitrila (ACN) numa proporção de 1:3 (v/v) (ou seja, para fazer 40 μL de reagente, combinar 10 μL de anidrido propiónico com 30 μL de ACN).
NOTA: Tradicionalmente, metanol ou isopropanol têm sido usados na preparação de um reagente de propionilação. Como a propionilação é uma reação de formação de amida, um solvente não protônico, como a acetonitrila, é necessário para evitar produtos colaterais e reações indesejadas, como o éster metilpropionílico, que resulta do uso de metanol. Prepare apenas um reagente de propionilação suficiente para até 4 amostras de cada vez para que o reagente permaneça fresco. Use o reagente dentro de 1-2 min de preparação. À medida que o reagente se assenta, o anidrido propiônico reagirá com qualquer umidade ambiente, e o ácido acético começará a se formar, o que pode alterar a eficácia do reagente e alterar o pH da solução de histona uma vez que o reagente é adicionado. - Adicionar o reagente de propionilação a cada amostra em um reagente de propionilação 1:4 (v/v) (ou seja, para 20 μL de histonas, adicionar 5 μL de reagente de propionilação).
- Adicione rapidamente NH4OH 1:5 (v/v) (ou seja, adicione 4 μL para 20 μL da solução de histona) para restabelecer o pH da solução para ~8. Se o pH ainda estiver muito baixo, adicione 1-2 μL de NH4OH de cada vez até atingir um pH de 8. Normalmente, uma proporção de 1:5 (v/v) é adequada.
- Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 minutos sem perturbação.
- Repetir a reação de propionilação para não mais do que 3-4 amostras por lote de reagente de propionilação para garantir uma formação mínima de ácido.
- Repetir as etapas do procedimento de propionilação 1.3.2-1.3.5. Uma segunda rodada de propionilação garante que >95% das lisinas disponíveis sejam derivatizadas.
- Secar as amostras até <5 μL utilizando um concentrador a vácuo. Isso evaporará qualquer reagente de propionilação não reagido, produtos ácidos e gás amônia liberados do NH4OH. Se as amostras secarem completamente, isso é bom, pois não ocorrem perdas significativas de amostras.
NOTA: Deslocar o ar no frasco de anidrido propiônico com gás argônio antes do armazenamento para evitar a formação de ácido acético devido ao contato com a umidade ambiente remanescente no frasco.
- Transferir 20 μg de histonas (determinadas pelo ensaio de proteínas) para um tubo limpo. Secar esta amostra até <5 μL usando um concentrador a vácuo e, em seguida, ressuspender usando 20 μL de bicarbonato de amônio 100 mM (NH4CO3) (~1 μg/μL solução). Ajuste o pH para ~8 usando hidróxido de amônio, se necessário.
- Digestão proteolítica com tripsina
- Ressuspender histonas em 100 mM NH4HCO3 para atingir um volume de 20 μL, atingindo uma concentração ótima de 1 μg/μL.
NOTA: Soluções de amostra com concentrações inferiores a 1 μg/μL resultarão na diminuição da eficiência da tripsina. - Adicionar tripsina às amostras de histonas na proporção de 1:10 (m/m) (ou seja, adicionar 2 μL de solução de 1 μg/μL de tripsina a 20 μg de histonas).
- Incubar as reações a 37 °C durante 6-8 h. Alternativamente, incubar durante a noite (12-18 h) à temperatura ambiente.
- Interromper a digestão congelando a -80 °C durante, pelo menos, 1 h.
NOTA: Não use ácido para apagar a reação de digestão, pois isso causará uma queda indesejada no pH neste ponto do procedimento. A amostra pode ser armazenada a -80 °C até estar pronta para prosseguir (ponto de paragem intercalar).
- Ressuspender histonas em 100 mM NH4HCO3 para atingir um volume de 20 μL, atingindo uma concentração ótima de 1 μg/μL.
- Derivatização química (propionilação) do peptídeo N-terminais
- Secar as amostras até <5 μL utilizando um concentrador a vácuo.
- Ressuspender as amostras até 20 μL (1 μg/μL) usando 100 mM NH4HCO3.
- Repetir a propionilação como antes (passo 1.3).
OBS: É normal que as amostras demorem mais para secar nesta etapa devido a uma maior relação de fase aquosa:orgânica.
- Dessalinização de amostras com pontas de estágio
- Ressuspender ou diluir as amostras com 50 μL de água grau MS + 0,1% TFA.
- Usando um coletor de amostras de 11 G, perfure 5 discos de material C18 de um disco de extração em fase sólida (perfure todos os 5 discos antes de transferir para a ponta da pipeta). Insira e certifique-se de que os discos estejam encravados de forma segura e uniforme na parte inferior de uma ponta de pipeta de 200 μL (Figura 1).
NOTA: Use o corer de 15 G se dessalgar mais de 25 μg de amostra através de uma única ponta de estágio. - Use um adaptador de centrífuga para manter as pontas do estágio no lugar em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL ou 2 mL.
NOTA: Para as seguintes etapas de centrifugação, use rotação lenta (400-500 x g) a 4 °C, por 1-2 min de cada vez; os solventes normalmente passam através da resina em menos de 1 min, dependendo de quão firmemente o material C18 é embalado nas pontas. - Enxaguar a resina centrifugando com 50 μL de acetonitrila a 100% para ativar o material C18 e remover potenciais contaminantes.
NOTA: Pode ser mais fácil carregar soluções nas pontas do palco usando pontas de pipeta de carregamento de gel. Uma vez que o material C18 tenha sido ativado, é importante não permitir que a resina seque durante o procedimento de dessalinização. - Equilibrar o material do disco com 80 μL de água grau MS + 0,1% TFA por centrifugação.
- Acidificar a amostra a pH 4 ou inferior utilizando ácido acético glacial. Verifique o pH com tiras de pH como antes para minimizar a perda de amostra.
- Carregue a totalidade da amostra no disco de resina por centrifugação lenta.
- Lavar a amostra com 80 μL de água grau MS + TFA 0,1% por centrifugação.
- Eluir a amostra em um tubo limpo de 1,5 mL lavando 70 μL de acetonitrila a 75% e ácido acético a 0,5% por centrifugação lenta. Tempo de centrifugação adicional pode ser usado para garantir que o volume total da amostra seja eluído da ponta do estágio. Tudo bem se a resina secar com o tempo adicional de centrifugação, pois ela não é mais necessária após a eluição da amostra.
- Secar completamente cada amostra em um concentrador a vácuo.
NOTA: A(s) amostra(s) pode(m) ser armazenada(s) a -80 °C até que estejam prontas para prosseguir (ponto de paragem provisório). - Para a análise de LC-MS/MS, reconstituir as amostras em um volume de Solvente A (0,1% de ácido fórmico) a partir do protocolo de cromatografia líquida (LC) que fornece a concentração final de 0,4 μg/μL (ou seja, dissolver 20 μg de histonas em 50 μL de Solvente A).
2. Interface do software TIMS
- Selecione a guia Instrumento e alterne para Operar (verifique se o nome do instrumento fica realçado em verde) (Figura 2).
- Verifique os parâmetros do TIMS (Figura 2).
- Verifique as configurações do MS (início da varredura, fim da varredura, polaridade do íon, modo de varredura) (Figura 2).
- Verifique as configurações do TIMS (modo, início da mobilidade, fim da mobilidade, tempo de rampa, tempo de acumulação, ciclo de trabalho, taxa de rampa, taxa de EM, média de EM e calibração automática) (Figura 2).
- Vá para a guia Source e ative a opção de seringa (Hamilton 500 μL) somente para a etapa de calibração do TuneMix (Figura 3)13.
- Vá para a guia Calibração , clique em m/z, selecione Modo de calibração e escolha o modo (Q avançado, geralmente), zoom (+0,01%) STD Dev (0,24) e clique em Calibrar; quando atingir 100% de pontuação, aceitar (Figura 4).
- Vá para a aba mobilidade e repita o processo de calibração (Modo Linear, geralmente), faixa de detecção (+5%), largura (0,1 Da), STD Dev (0,1855), depois clique em calibrar; quando obtiver uma pontuação ≥ 98,5%, aceite (Figura 5).
- Vá até o método e selecione o método a ser utilizado; para este exemplo, Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl foi selecionado (Figura 5).
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS
- Use as condições de operação nESI típicas: tensão capilar de 4500 V, deslocamento da placa terminal de 800 V, pressão do nebulizador de 3,0 bar, gás seco de 10,0 L/min, aquecedor seco de 200 °C e vazão de injeção de 50 μL/min.
- Use as configurações típicas de MS: energia de colisão de 6 eV, RF de colisão de 1200 Vpp, tempo de transferência de 75 μs, armazenamento de pré-pulso de 5 μs.
- Determinar o fluxo de gás de deriva usando a diferença de pressão do funil de entrada P1 e do funil de saída P2. A acumulação paralela-fragmentação seriada (PASEF) ocorre na célula TIMS, acumulando todos os íons precursores simultaneamente em vez de individualmente. Os íons precursores são então liberados em picos de íons estreitos versus os picos normalmente muito mais largos (cerca de 50 vezes mais curtos), aumentando a relação sinal-ruído enquanto ainda separam peptídeos coeluídos via mobilidade14.
- Desenvolver um método LC-TIMS-ToF MS/MS para análise de peptídeos de histonas proteolíticas. Junte um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) equipado com uma coluna C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) com um instrumento comercial TIMS-TOF MS com tecnologia PASEF proprietária.
NOTA: O tamanho desta coluna foi determinado para proporcionar uma boa separação em pH alto e baixo para misturas peptídicas, com base em trabalhos publicados anteriormente 15,16,17.- Ajustar o volume de injeção para 20 μL (8 μg) de amostra e um fluxo de 0,4 mL/min.
- Executar um gradiente de LC não linear de 60 minutos usando água com 0,1% de ácido fórmico (Solvente A) e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (Solvente B). Ajuste o gradiente: 10% B por 2,7 min, depois para 20% B em 5,3 min, 28% B em 4 min, 35% B em mais 18 min, 40% B em 13 min e 100% B em mais 2 min. Após segurar 100% B por 5 min, diminuir a concentração para 10% B em 5 min e segurar pelos 5 min finais.
- Verificar a eluição da amostra da HPLC para o TIMS-TOF via ionização por nano-electrospray (nESI) no modo de ionização positiva.
4. Análise dos dados
- Identificar as sequências peptídicas e os locais de modificação.
- Prepare uma lista teórica de peptídeos usando ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] sob a ferramenta MS-digest.
- Realizar um digesto teórico levando em consideração as condições do digesto (enzima usada), os tipos de PTMs que estão sendo pesquisados (por exemplo, mono-, di-, ou trimetilação), a faixa de tamanho de peptídeos que estão sendo procurados, bem como a faixa de detecção de massa e o número potencial de clivagens perdidas.
- Prepare uma lista teórica de peptídeos usando ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] sob a ferramenta MS-digest.
- Analise manualmente os dados adquiridos com base em peptídeos teóricos (Figura 6)12.
- Procuram-se as massas em vários estados de carga (+1 a +4) para cada peptídeo teórico.
- Após a identificação inicial de cada m/z, selecione o pico e confirme o MS/MS usando uma lista teórica de íons de fragmentação baseada na sequência peptídica, incluindo PTMs.
NOTA: Se a mobilidade do peptídeo identificado era conhecida anteriormente, isso também é confirmado.
- Calcule as abundâncias relativas de vários PTMs e relate cada modificação como uma porcentagem da sequência peptídica especificada.
- A abundância relativa de cada PTM detectado é calculada usando a seguinte equação:
Abundância relativa = Área de PTM/Área total de PTMs e não modificadas para um dado peptídeo
- A abundância relativa de cada PTM detectado é calculada usando a seguinte equação:
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Representative Results
Um fluxo de trabalho proteômico ascendente (Figura 7) tipicamente envolve o seguinte: extração da(s) proteína(s) alvo(s) de uma amostra bruta, seguida da quantificação da concentração da(s) proteína(s) e, em seguida, fracionamento, geralmente por eletroforese em gel ou cromatografia líquida. Após o fracionamento, as proteínas são digeridas usando uma enzima proteolítica (muitas vezes tripsina) e, finalmente, análise espectrométrica de massa dos peptídeos resultantes e identificação proteica usando um banco de dados estabelecido18. As informações de sequência são derivadas de íons precursores dentro da faixa massa-carga (m/z) indicada, que são submetidos à dissociação induzida por colisão (CID), produzindo padrões de fragmentação a serem identificados e sequenciados usando um banco de dados19 (Figura 8).
Para este trabalho, o objetivo principal foi desenvolver e aplicar um método LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA seguindo os passos descritos anteriormente na seção protocolo. A determinação da posicionalidade das modificações pós-traducionais em peptídeos isoméricos e isobáricos tem apresentado um desafio particular em relação à identificação e interpretação do espectro. Neste estudo, padrões de histonas humanas recombinantes e células HeLa S3 foram usados como amostras.
A análise de PTM de histona Histone de padrões de histonas humanas via ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS produziu peptídeos de médio a grande porte (3-30 aminoácidos de comprimento) detectados com até 5 cargas por peptídeo. O procedimento de propionilação foi bem sucedido na produção de peptídeos mais longos e informativos do que aqueles comumente produzidos pela digestão tríptica. Após a análise dos dados, peptídeos foram identificados em estados modificados variadamente. Como vantagem, o método baseado em TIMS diferenciou alguns peptídeos isoméricos posicionais portadores das mesmas PTMs. Por exemplo, duas espécies isoméricas podem se sobrepor em tempo de retenção e m/z; entretanto, os dois sinais puderam ser separados no domínio da mobilidade (Figura 9).
Os espectros de fragmentação correspondentes para os peptídeos mostrados na Figura 9 foram anotados por software de análise proteômica usando os arquivos FASTA apropriados. Na Figura 9A, o peptídeo não modificado é visto com três grupos propionil (+56,03) (no N-terminal, lisina 18 e lisina 23). Na Figura 9B, o peptídeo é observado com um grupo acetila (+42,02) na lisina 18 e dois grupos propionil (um no N-terminal e outro na lisina 23). Finalmente, na Figura 9C o peptídeo é visto com acetilação observada na lisina 23 e em dois grupos propionil (no N-terminal e lisina 18). Conforme publicado anteriormente, a vantagem do PASEF poderia ser usada para aumentar a velocidade e a sensibilidade do sequenciamento, visando o mesmo recurso repetidamente9. Isso permite que o usuário obtenha mais informações estruturais a partir de amostras biológicas. Nesse caso, isso é aplicado ao tipo e à posição dos PTMs que ocorrem em cada histona.
A análise de modificações pós-traducionais também pode ser representada visualmente como um gráfico de cobertura de sequência, como pode ser visto na Figura 10. Na Figura 10A, o padrão H3 da histona, que foi propionilado antes da digestão, apresenta peptídeos mais longos do que teria resultado de outra forma, denotados pelas linhas azuis. As histonas extraídas das células HeLa S3 foram processadas da mesma forma, conforme representado na Figura 10B. Vários PTMs foram indicados, incluindo muitos padrões diferentes nas mesmas posições de aminoácidos. Isso é de se esperar a partir de amostras biológicas. Vale ressaltar que as poucas linhas cinzas da Figura 10B denotam peptídeos que foram identificados de forma ambígua devido à ausência de um MS2 resultante da baixa intensidade.
Figura 1: Representação esquemática e produção de pontas de palco. (A-G) Guia passo a passo sobre a fabricação de uma ponta de estágio de disco de sílica C18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processamento de dados: 20210804 Peptídeo Mix_QC Histonas Padrão Propioniladas. Antes de iniciar o processamento dos dados, certifique-se de preparar a lista teórica de possíveis estados de carga e suas fragmentações (1550.9013; 775.9543; 517.6386; etc.) para extrair esses valores do cromatograma de pico de base (BPC + All MS). Depois de extrair cada peptídeo, certifique-se de que se parece com a lista de análise mostrada na figura. O pico 775,9543 foi selecionado como exemplo. No lado direito da figura, três gráficos são mostrados: o primeiro corresponde ao cromatograma (gráfico intensidade vs. tempo), o segundo ao mobilograma e o terceiro ao espectro de massa com fragmentação PASEF incluída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Etapas 1 a 4 do protocolo timsControl. A figura mostra os quatro primeiros passos do procedimento timsControl. No canto superior esquerdo, clique no botão Instrumento para ativar e desativar a conexão entre o instrumento e o software. Antes de executar qualquer tarefa, deve-se garantir que o software esteja no modo de operação. Por fim, verifique se os parâmetros do TIMS estão corretos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Parâmetros de origem. Neste caso, a seringa Hamilton 500 μL foi usada apenas para o TuneMix. Verifique se os outros parâmetros permanecem corretos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Calibração massa-carga (m/z). Selecione Calibrar até que uma pontuação de 100% tenha sido obtida no Modo de calibração do painel inferior esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Calibração da mobilidade. Selecione Calibrar até que uma pontuação de pelo menos 98,5% tenha sido obtida no Modo de calibração do painel inferior esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Fluxo de trabalho proteômico típico de baixo para cima. Passo a passo dos procedimentos ascendentes desde a preparação da amostra até à identificação9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Tempo de retenção, padrão isotópico e perfis de mobilidade H3 18-26. (A) propionilado não modificado, (B) peptídeo K23Ac propionilado nas outras duas posições e (C) propionilado K18Ac nas outras duas posições. Observe as vantagens da separação de mobilidade para o caso dos isômeros estruturais mostrados nos painéis B e C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Exemplo de sequenciamento de peptídeo de fragmentação MS/MS usando PASEF. Os espectros dos fragmentos foram obtidos a partir de um software de análise proteômica para o peptídeo H3 com posições de aminoácidos 18-26. (A) propionilado não modificado, (B) peptídeo K23Ac propionilado nas outras duas posições e (C) propionilado K18Ac nas outras duas posições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Exemplo de um resumo da análise de PTM de histona visual. Resultados de peptídeos e PTMs observados de (A) um padrão H3 e (B) H3 de células HeLa S3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Características padrão e do peptídeo HeLa S3 LC-TIMS-ToF MS/MS. Lista de peptídeos alvo e observados, incluindo propriedades experimentais (i.e., tempo de retenção, m/z, 1/Ko e áreas de pico de LC). Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
As histonas são proteínas básicas que regulam a estrutura da cromatina interagindo com o DNA na forma de octâmeros constituídos pelas quatro histonas centrais (duas de H2A, H2B, H3 e H4)20. As histonas contêm numerosos resíduos de lisina e arginina, que são prontamente modificados, levando a extensas MPTs que alteram a química da cromatina influenciando a função das histonas ou ligando-se a outras proteínas celulares21. As MPT podem provocar respostas biológicas trabalhando em conjunto, sendo que grupos específicos de MPT têm sido relatados em várias doenças, com destaque para vários tipos decâncer22.
Quando o dano ao DNA é reconhecido em nível celular, ele é instantaneamente seguido pela ação de uma complexa cascata de sinalização onde as lesões são marcadas, seguida pela coordenação da progressão do ciclo celular e ativação das vias de reparo necessárias. Além disso, o dano ao DNA induz várias modificações, como adutos de acetila e metila, que facilitam o recrutamento de proteínas23. A grande variedade de MPTs envolvidas em lesões de DNA leva ao questionamento de como esses mecanismos moleculares regulam sua coexistência e qual a importância funcional de defender a integridade do genoma através de uma rede integrada extremamente complexa. Por exemplo, a trimetilação da histona H3 (H3K9me3) de lisina 9 tem sido associada a diferentes patologias em várias doenças24. Por razões como essa, faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias analíticas instrumentais que permitam a caracterização completa dessas modificações em nívelcelular23.
A análise das extrações de histonas HeLa S3 usando software de análise manual de dados e software de análise proteômica revelou MPTs, incluindo acetilação (+42,01 Da), metil-propionilação (+70,04 Da), dimetilação (+28,03 Da) e trimetilação (+42,05) para várias proteínas de histonas. Além disso, o método MS/MS baseado em PASEF foi capaz de diferenciar alguns peptídeos isoméricos posicionais portadores das mesmas MPTs.
Na introdução, as vantagens do acoplamento LC-TIMS-ToF MS/MS no estudo de MPTs para mostrar os desenvolvimentos recentes da DDA usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão são brevemente descritas. A ideia principal é estabelecer uma metodologia que permita a resolução de sinais provenientes de diferentes peptídeos e que, até agora, as técnicas clássicas não foram capazes de resolver. O processo de derivatização utilizando anidrido propiônico previne a clivagem dos terminais-C de lisina pela tripsina, gerando peptídeos mais longos e informativos. Peptídeos com o mesmo m/z e tempo de retenção puderam ser identificados por seus padrões de fragmentação, mas também foi visto que algumas dessas espécies poderiam ser separadas no domínio da mobilidade usando este método LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS.
Para melhor compreensão disso, a Figura 8 representa três características principais de qualquer molécula, permitindo assim a identificação de um composto, sejam elas proteínas intactas, lipídios ou peptídeos (no caso, a histona H3 18-26), para citar alguns exemplos. Essas características incluem o tempo de retenção (min) de um composto na coluna cromatográfica, a relação massa-carga (m/z) de cada composto e a mobilidade (1/Ko) que esses compostos apresentam quando interagem com o gás de deriva. Na Figura 8A, o peptídeo H3 18-26 não modificado apresenta TR de 28,15 min e duas bandas em seu espectro de mobilidade, indicando que possui pelo menos duas conformações, resultado que se suspeita ser resultado das duas lisinas (18 e 23) que foram propionilados seguindo o protocolo descrito anteriormente. Os espectros seguintes (Figura 8B,C) mostram o mesmo peptídeo (H3 18-26), mas variando a posição do grupo de acetilação (42,02) entre B, K18Ac e C, K23Ac. Esses dois isômeros (K18Ac e K23Ac) foram identificados através do mobilograma, pois apresentam diferentes distribuições espaciais, o que resulta em diferentes interações com o gás na célula TIMS. A importância desse método reside na possibilidade de identificar e estudar mais detalhadamente as diferentes MPTs que têm sido associadas a diferentes doenças através, por exemplo, de danos ao DNA.
Quando os dados de fragmentação são escassos, identificar uma modificação em um resíduo específico é um desafio, pois duas ou mais modificações diferentes podem ocorrer simultaneamente (ou próximas) nos mesmos resíduos e podem ser entendidas como uma única modificação25. Isso poderia ser resolvido garantindo que o peptídeo não modificado tenha sido identificado, especialmente usando um padrão para confirmar ou negar a presença de uma única modificação em vez de múltiplas modificações (Tabela 1).
Para evitar contaminação excessiva ou extrações de histonas impuras, é importante verificar a qualidade dos reagentes antes do uso. Por exemplo, se a solução tampão NIB for armazenada e usada a granel, certifique-se de que a solução esteja límpida sem aparência externa de turbidez ou apresentação anormal. A turbidez pode ser o resultado do crescimento bacteriano, o que contaminaria as amostras e poderia resultar em uma mistura de histonas e proteínas bacterianas. Além disso, recomenda-se preparar novas curvas de calibração para ensaios, como o ensaio BCA ou Bradford usado para determinar a concentração de proteínas, garantindo que a proteína usada para a curva de calibração não esteja expirada ou degradada.
Este método pode ser estendido a outros tipos de células ou organismos, por exemplo, mosquitos. No caso de organismos inteiros ou parciais, a selecção de um número adequado de organismos é especialmente importante para garantir que a concentração final de histonas é adequada para análise.
Além disso, como uma diretriz geral para a manutenção do espectrômetro de massa, a extremidade dianteira deve ser limpa periodicamente para evitar acúmulo no instrumento e contaminação entre as corridas. Essa limpeza deve incluir a cortina, a placa do orifício e o quadrupolo, conforme necessário.
Geralmente, quando um LC é usado, é necessário levar em consideração a preparação de novas fases móveis a cada semana usando solventes de grau MS. É uma boa prática manter pipetas e vidrarias dedicadas para a preparação de fases móveis e limpar as linhas LC sempre que novas soluções forem colocadas no sistema. As colunas de proteção e separação geralmente devem ser substituídas a cada 100-200 injeções e 500-1500 injeções, respectivamente26. Certifique-se de injetar espaços em branco antes e depois de executar um lote de amostras. Se houver um grande número de amostras dentro de um determinado lote, pode-se também considerar a execução de um branco em vários intervalos dentro do lote.
O protocolo fornece um fluxo de trabalho DDA baseado em PASEF para detecção de PTMs de histonas e diferenciação de espécies isobáricas e isoméricas com base na mobilidade iônica.
Este protocolo requer uma preparação extensiva da amostra, e o tempo total de preparação da amostra experimental deve ser considerado. Em média, o protocolo de preparação da amostra requer de 2 a 3 dias úteis para ser concluído. Além disso, diferenças entre laboratórios e versões de instrumentos podem afetar a sensibilidade geral da análise.
Poucos softwares de análise de dados proteômicos foram considerados adequados para uso na análise de histonas por métodos bottom-up sem ajuste ou correção manual 27,28,29. Os resultados devem (pelo menos em um primeiro momento) ser confirmados usando análise manual, que também é demorada. Se o software analítico for usado, ele deve ter recursos de anotação do MS/MS, que geralmente são fáceis de confirmar ou rejeitar.
Também vale a pena mencionar que é impossível separar isômeros através de espectrometria de massa a menos que uma célula TIMS seja inserida e valores de mobilidade sejam usados; por exemplo, as posições das modificações de histonas podem ser determinadas usando padrões de fragmentação (PASEF).
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Disclosures
Melvin A. Park e Matthew Willetts são funcionários da Bruker Daltonics Inc., fabricante do instrumento timsTOF.
Acknowledgments
Este material é baseado em trabalho apoiado pela National Science Foundation sob o Grant No. HRD-1547798 e Bolsa nº. HRD-2111661. Essas bolsas da NSF foram concedidas à Florida International University como parte do Programa Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Esta é a contribuição número 1672 do Institute of Environment, um programa proeminente da Florida International University. O apoio adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Saúde sob a Bolsa nº. R21AI135469 a Francisco Fernandez-Lima e Grant nº. R01HD106051 a Benjamin A. Garcia, bem como pela National Science Foundation sob o Grant No. CHE-2127882 para Benjamin A. Garcia. Os autores gostariam de agradecer o apoio inicial do Dr. Mario Gomez Hernandez durante o desenvolvimento inicial do método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
