Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Скрининг модификации гистонов с использованием жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65589
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Summary

Аналитический рабочий процесс, основанный на жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии (LC-TIMS-ToF MS/MS) для высокодостоверного и высоковоспроизводимого анализа модификаций гистонов «снизу вверх» и идентификации на основе основных параметров (время удержания [RT], поперечное сечение столкновения [CCS] и точное отношение массы к заряду [m/z]).

Abstract

Белки гистонов очень распространены и консервативны среди эукариот и играют большую роль в регуляции генов в результате структур, известных как посттрансляционные модификации (PTM). Идентификация положения и природы каждого ПТМ или паттерна ПТМ в связи с внешними или генетическими факторами позволяет статистически коррелировать эту информацию с биологическими реакциями, такими как транскрипция, репликация или репарация ДНК. В настоящей работе описан высокопроизводительный аналитический протокол детектирования гистоновых ПТМ из биологических образцов. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии (ЖХ-ТИМС-TOF МС/МС) позволяет разделять и присваивать ПТМ наиболее биологически значимые модификации в одном анализе. Описанный подход использует преимущества последних разработок в области зависимого сбора данных (DDA) с использованием параллельного накопления в ловушке подвижности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, вызванной столкновением. ПТМ гистонов надежно назначаются в зависимости от времени их удержания, подвижности и характера фрагментации.

Introduction

В эукариотических клетках ДНК упакована в виде хроматина в функциональные единицы, называемые нуклеосомами. Эти единицы состоят из октамера из четырех основных гистонов (по два H2A, H2B, H3 и H4)1,2,3,4. Гистоны являются одними из самых распространенных и высококонсервативных белков у эукариот, которые в значительной степени ответственныза регуляцию генов. Посттрансляционные модификации гистонов (ПТМ) играют большую роль в регуляции динамики хроматина и управляют различными биологическими процессами, такими как транскрипция, репликацияи репарация ДНК. ПТМ встречаются в основном на доступной поверхности N-концевых участков гистонов, контактирующих с ДНК 3,7. Однако модификации хвоста и ядра влияют на структуру хроматина, изменяя межнуклеосомные взаимодействия и рекрутируя специфические белки 3,8.

Актуальной проблемой при протеомике на основе жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) является потенциальное совместное элюирование интересующих аналитов. В случае анализа, зависящего от данных (DDA), это приводит к потенциальной потере нескольких ионов-предшественников в процессе регистрации MS/MS9. Времяпролетные приборы (ToF) регистрируют спектры на очень высокой частоте 9,10 (до десятков кГц)11; Это делает их способными быстро сканировать общее количество ионов-предшественников в комплексном образце (MS1), что обеспечивает оптимальную чувствительность и скорость секвенирования MS/MS (до 100 Гц)9 и делает их идеальными для анализа биологическихобразцов10. Тем не менее, чувствительность, доступная при таких высоких скоростях сканирования, ограничена скоростью MS/MS9. Для смягчения этих ограничений было использовано добавление спектрометрии подвижности захваченных ионов (TIMS) в сочетании с ортогональным квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром (qToF). В TIMS все ионы-предшественники накапливаются в тандеме и элюируются в зависимости от их подвижности, а не выбирают одиночные массы прекурсоров с помощью квадруполя9. Параллельная последовательная фрагментация накопления (PASEF) позволяет обрабатывать сотни событий MS/MS в секунду без потери чувствительности9.

Основная цель данной работы состояла в том, чтобы показать последние разработки ДДА с использованием параллельного накопления в ловушке подвижности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, индуцированной столкновением (CID). ПТМ гистонов были уверенно распределены на основе их времени удержания (RT), подвижности и характера фрагментации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы гистонов были извлечены с использованием метода, адаптированного из Bhanu et al. (2020)12.

1. Пробоподготовка

  1. Сбор культивируемых клеток
    1. Когда клетки сливаются на 80%, убедитесь, что они жизнеспособны, используя исключение трипанового синего.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов использовалась клеточная линия HeLa S3, но этот метод может быть применен к любым культивируемым клеткам.
    2. Аспирируйте среду, затем нанесите 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) на каждую пластину.
    3. Вкрутите пластину (пластины), чтобы промыть все остатки среды, затем аспирируйте PBS и нанесите 5 мл 1x PBS.
    4. Аккуратно отделите клетки от пластины, соскоблив их одноразовым подъемником клеток.
    5. Переложите каждую клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
    6. Гранулируйте клетки центрифугированием при 800 x g в течение 5 мин.
    7. Аспирируйте PBS из клеточной гранулы.
    8. Приступают к экстракции гистонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мгновенная заморозка гранул ячейки в жидком азоте, если она не может быть обработана немедленно. Храните гранулы при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к работе.
  2. Экстракция гистонов
    1. Оцените объем каждой гранулы клетки и отметьте мениск перманентным маркером.
    2. Для всех образцов подготовьте достаточное количество ядерного изоляционного буфера (NIB; 15 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 15 мМ NaCl, 60 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМCaCl2 и 250 мМ сахарозы). В качестве альтернативы, если необходимо обработать много образцов в течение длительного времени, сделайте буфер навалом и храните при температуре 2-8 °C до 6 месяцев или аликвотируйте и замораживайте при температуре от -15 °C до -25 °C неограниченное время, размораживая только количество, необходимое для каждой экстракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен оставаться чистым во время хранения. Если буфер приобретет мутный или другой ненормальный вид в любое время, выбросьте и приготовьте новый буфер.
    3. Приготовьте гранулы, в 50 раз превышающие объем клеточных гранул промывочного буфера, и добавьте ингибиторы следующим образом (примерно 10 мл промывочного буфера на 2 образца).
      1. Для приготовления 10 мл промывочного буфера смешают 10 мл NIB, 30 мкл 200 мМ 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида гидрохлорида [AEBSF], 10 мкл 1 М дитиотрейтола [DTT], 20 мкл 5 мкМ микроцистина, 20 мкл 5 М бутирата натрия.
    4. Удалите 1/5 промывочного буфера для приготовления буфера лизиса (1/5 объема из промывочного буфера, 0,3% альтернатива NP-40 или NP-40).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте Triton-X 100 вместо альтернативы NP-40 или NP-40, так как он может быть слишком абразивным для некоторых типов клеток.
    5. Тщательно промойте гранулы клеток, суспендировав их в 5 колонках промывочного буфера и центрифугируя при 800 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выполните этот шаг дважды, отсасывая и выбрасывая надосадочную жидкость между стирками.
    6. Убедитесь, что объем гранулы ячейки по-прежнему отмечен перманентным маркером. Ресуспендировать в 10 объемах лизисного буфера.
    7. Пипетки тщательно перемешайте каждую гранулу, чтобы повторно взвесить, затем инкубируйте в течение 15 минут на льду.
    8. Через 15 мин центрифугу при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    9. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула должна уменьшиться до ≤ 1/2 от первоначального размера гранулы (как указано маркерной линией). Если гранулы не уменьшились в достаточной степени, повторите процедуру лизиса и включите осторожный этап гомогенизации с использованием пестика, чтобы разбить клетки.
    10. После завершения лизиса повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл промывочного буфера, затем центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость, затем повторите этап промывки еще раз, чтобы удалить все следы NP-40.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гранула состоит из хроматина, который содержит гистоны.
    11. Ресуспендируйте гранулу в 5 объемах (исходного размера гранулы) по 0,4 Н НН 2СО4.
    12. Выдерживают в течение 2 ч в холодном помещении или холодильнике с помощью мешалки.
    13. Через 2 ч центрифугируют образец(ы) при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Не выбрасывайте надосадочную жидкость.
    14. Перелейте надосадочную жидкость в новые пробирки и добавьте 100% трихлоруксусную кислоту (ТСА) до 1/3 объема содержимого (конечная концентрация ТСА составит примерно 20%).
    15. Осторожно переверните пробирку и посмотрите, что прозрачный бесцветный раствор становится белым и/или мутным, что указывает на выпадение белка в осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворов с низкой концентрацией гистонов осаждение белка может быть не сразу заметно, но осадок должен быть виден после ночной инкубации.
    16. Инкубировать без помех в течение ночи (12-18 ч) при 4 °C до полного осаждения белков-гистонов.
    17. На следующий день центрифугу при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    18. Отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не касаться наконечником пипетки стенок пробирки. На этом этапе гистоны осаждаются в основном в виде пленки по бокам трубки (трубок).
    19. Добавьте 500 мкл ледяного ацетона + 0,1% HCl (кислотный ацетон) в каждую пробирку с помощью стеклянной пипетки Пастера, затем осторожно переверните пробирку (пробирки) несколько раз. При этом расположите образцы по порядку (1, 2, 3 и т. д.), так как любой случайный ацетон может удалить маркировку на пробирках. Центрифугу при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно сцеживайте надосадочную жидкость.
    20. Повторите этот этап полоскания с 500 мкл ледяного 100% ацетона, а также стеклянной пипеткой Пастера. Центрифугу при 3400 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно сцеживайте надосадочную жидкость.
    21. Оставьте пробирки открытыми для просушки при комнатной температуре, пока не испарится оставшийся ацетон.
    22. После высыхания добавьте в каждую пробирку 100 мкл воды масс-спектрометрического качества (MS). Используйте эту каплю для взятия мазка со всех сторон контейнера, чтобы повторно суспендировать всю гистоновую пленку. Для этого каплю можно выложить на боковую сторону пробирки и вращать ее, пипетируя вверх и вниз или дозируя половину из 100 мкл и перемешивая ее с помощью наконечника. Лучше всего работает комбинация обоих методов. Гистоны легко растворяются в воде и будут находиться в растворе.
    23. После ресуспендирования всех образцов, если осталось белое твердое вещество, проведите ультразвуковую обработку в ванне при комнатной температуре в течение 5 минут.
    24. Центрифуга при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Перелейте прозрачный раствор в свежие тюбики. Выбросьте оставшиеся нерастворимые гранулы.
    25. Запустите SDS-PAGE в восстановительных условиях, чтобы убедиться в чистоте экстракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гели можно использовать с использованием любой подходящей концентрации полиакриламида при условии, что он может дифференцировать белки в диапазоне 10-20 кДа. Гели, используемые в этом протоколе, см. в Таблице материалов.
    26. Проведите анализ концентрации белка (например, по Брэдфорду или BCA), чтобы определить общую концентрацию белка.
  3. Химическая дериватизация (пропионилирование) остатков лизина
    1. Перенесите 20 мкг гистонов (определяемых с помощью анализа белка) в чистую пробирку. Высушите этот образец до <5 мкл с помощью вакуумного концентратора, затем ресуспендируйте с помощью 20 мкл бикарбоната аммония 100 мМ (NH4CO3) (~1 мкг/мкл раствора). При необходимости отрегулируйте pH до ~8, используя гидроксид аммония.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте гидроксид аммония (NH4OH) для ресуспендирования, только для регулировки pH, если это необходимо. В противном случае белки будут денатурировать и выпадать в осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить рН с минимальной потерей образца, используйте наконечник пипетки, чтобы окунуть образец и нанести на pH-полоску. Эта процедура испытаний будет полезна на всех остальных этапах пробоподготовки.
    2. Приготовьте реагент для пропионилирования, добавив пропионовый ангидрид к ацетонитрилу (ACN) в соотношении 1:3 (v/v) (т.е. для получения 40 мкл реагента соедините 10 мкл пропионового ангидрида с 30 мкл ACN).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционно метанол или изопропанол использовались для приготовления реагента для пропионилирования. Поскольку пропионилирование представляет собой реакцию образования амидов, для предотвращения нежелательных побочных продуктов и реакций, таких как метилпропиониловый эфир, который образуется в результате использования метанола, требуется непротонный растворитель, такой как ацетонитрил. Готовьте достаточное количество реагента для пропионилирования только для 4 образцов одновременно, чтобы реагент оставался свежим. Используйте реагент в течение 1-2 минут после приготовления. По мере того, как реагент находится, пропионовый ангидрид вступит в реакцию с любой окружающей влагой, и начнет образовываться уксусная кислота, которая может изменить эффективность реагента и изменит рН раствора гистонов после добавления реагента.
    3. Добавьте реагент пропионилирования к каждому образцу в соотношении 1:4 (v/v) (т.е. для 20 мкл гистонов добавьте 5 мкл реагента пропионилирования).
    4. Быстро добавьте 1:5 (v/v) NH4OH (т. е. добавьте 4 мкл на 20 мкл раствора гистонов), чтобы восстановить pH раствора до ~8. Если рН все еще слишком низкий, добавляйте 1-2 мкл NH4OH за раз, пока не будет достигнут рН 8. Как правило, соотношение 1:5 (v/v) является достаточным.
    5. Инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 15 мин без помех.
    6. Реакцию пропионилирования повторяют не более чем для 3-4 образцов на партию реагента пропионилирования, чтобы обеспечить минимальное кислотообразование.
    7. Повторите процедуру пропионилирования шаги 1.3.2-1.3.5. Второй раунд пропионилирования гарантирует, что >95% доступных лизинов дериватизируются.
    8. Высушите образцы до <5 мкл с помощью вакуумного концентратора. Это позволит испарить любой непрореагировавший реагент пропионилирования, кислотные продукты и газообразный аммиак, выделяемый из NH4OH. Если образцы полностью высохнут, это нормально, так как существенных потерь проб не происходит.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хранением вытесните воздух в баллоне с пропионовым ангидридом газообразным аргоном, чтобы предотвратить образование уксусной кислоты из-за контакта с окружающей влагой, оставшейся в бутылке.
  4. Протеолитическое расщепление с трипсином
    1. Ресуспендируйте гистоны в 100 мМ NH4HCO3 для достижения объема 20 мкл, достигая оптимальной концентрации 1 мкг/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы образцов с концентрацией ниже 1 мкг/мкл приведут к снижению эффективности трипсина.
    2. Добавляют трипсин к образцам гистонов в соотношении 1:10 (масса/масса) (т.е. добавляют 2 мкл 1 мкг/мкл раствора трипсина к 20 мкг гистонов).
    3. Инкубируют реакции при 37 °С в течение 6-8 ч. В качестве альтернативы инкубируйте в течение ночи (12-18 ч) при комнатной температуре.
    4. Остановите пищеварение, заморозив при -80 °C не менее чем на 1 час.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте кислоту для подавления реакции пищеварения, так как это вызовет нежелательное снижение pH на этом этапе процедуры. Образец можно хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока он не будет готов к работе (промежуточная точка остановки).
  5. Химическая дериватизация (пропионилирование) пептидных N-концев
    1. Высушите образцы до <5 мкл с помощью вакуумного концентратора.
    2. Ресуспендируйте образцы до 20 мкл (1 мкг/мкл) с использованием 100 мМ NH4HCO3.
    3. Повторите пропионилирование, как и раньше (шаг 1.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, что образцам требуется больше времени для высыхания на этом этапе из-за более высокого соотношения водной и органической фаз.
  6. Обессоливание проб с помощью ступенчатых наконечников
    1. Ресуспендировать или разбавить образцы 50 мкл воды MS-класса + 0,1% TFA.
    2. С помощью отборщика проб 11-G пробейте 5 дисков материала C18 из твердофазного экстракционного диска (пробивите все 5 дисков перед переносом на наконечник пипетки). Вставьте и убедитесь, что диски надежно и равномерно заклинены в нижней части наконечника дозатора объемом 200 мкл (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте керн 15 г при обессоливании более 25 мкг образца через одноступенчатый наконечник.
    3. Используйте адаптер для центрифуги, чтобы удерживать наконечники столиков на месте в пробирках для микроцентрифуг объемом 1,5 мл или 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих этапов центрифугирования используйте медленный (400-500 x g) оборот при 4 °C в течение 1-2 минут за раз; растворители обычно проходят через смолу менее чем за 1 минуту, в зависимости от того, насколько плотно материал C18 упакован в наконечники.
    4. Промойте смолу центрифугированием с 50 мкл 100% ацетонитрила, чтобы активировать материал C18 и удалить потенциальные загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, будет проще загружать растворы на наконечники для дозаторов с гелевой загрузкой. После активации материала C18 важно не допустить высыхания смолы в течение всей процедуры обессоливания.
    5. Центрифугированием уравновешивают материал диска 80 мкл воды MS-класса + 0,1% TFA.
    6. Подкислите образец до рН 4 или ниже с помощью ледяной уксусной кислоты. Проверяйте pH с помощью pH-полосок, как и раньше, чтобы свести к минимуму потери пробы.
    7. Загрузите весь образец на диск из смолы путем медленного центрифугирования.
    8. Промыть образец 80 мкл воды MS-класса + 0,1% TFA путем центрифугирования.
    9. Элюируют образец в чистую пробирку объемом 1,5 мл, промывая 70 мкл 75% ацетонитрила и 0,5% уксусной кислоты медленным центрифугированием. Дополнительное время центрифугирования может быть использовано для обеспечения элюирования полного объема образца с наконечника предметного столика. Ничего страшного, если смола высохнет с дополнительным временем центрифугирования, так как она больше не нужна после элюирования образца.
    10. Полностью высушите каждый образец в вакуумном концентраторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы(ы) можно хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к работе (промежуточная точка остановки).
    11. Для анализа ЖХ-МС/МС восстановите образцы в объеме растворителя А (0,1% муравьиной кислоты) из протокола жидкостной хроматографии (ЖХ), который дает окончательную концентрацию 0,4 мкг/мкл (т. е. растворите 20 мкг гистонов в 50 мкл растворителя А).

2. Программный интерфейс TIMS

  1. Выберите вкладку «Прибор » и переключитесь в режим «Управление » (убедитесь, что название прибора выделено зеленым цветом) (рисунок 2).
  2. Проверьте параметры TIMS (рисунок 2).
  3. Проверьте настройки MS (начало сканирования, окончание сканирования, полярность ионов, режим сканирования) (рис. 2).
  4. Проверьте настройки TIMS (режим, начало подвижности, конец подвижности, время линейного изменения, время накопления, рабочий цикл, скорость линейного изменения, скорость MS, усреднение MS и автокалибровка) (рис. 2).
  5. Перейдите на вкладку «Источник » и активируйте опцию шприца (Hamilton 500 мкл) только для шага калибровки TuneMix (Рисунок 3)13.
  6. Перейдите на вкладку Calibration (Калибровка ), нажмите m/z, выберите Calibration Mode (Режим калибровки) и выберите режим (Enhanced Q, как правило), масштаб (+0.01%) STD Dev (0.24) и нажмите Calibrate (Калибровка); при достижении 100% баллов принять (рисунок 4).
  7. Перейдите на вкладку «Мобильность» и повторите процесс калибровки (как правило, линейный режим), диапазона обнаружения (+5%), ширины (0,1 Да), STD Dev (0,1855), затем нажмите «Калибровать»; когда вы получите оценку ≥ 98,5%, примите (рисунок 5).
  8. Перейдите к методу и выберите метод, который будет использоваться; Для этого примера был выбран Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (рис. 5).

3. ЖХ-ТИМС-ПАСЕФ-ToF МС/МС

  1. Используйте типичные условия эксплуатации nESI: капиллярное напряжение 4500 В, смещение торцевой пластины 800 В, давление небулайзера 3,0 бар, сухой газ 10,0 л/мин, сухой нагреватель 200 °C и расход впрыска 50 мкл/мин.
  2. Используйте типичные настройки MS: энергия столкновения 6 эВ, РЧ-частота столкновения 1200 В между пиками, время передачи 75 мкс, хранение предимпульса 5 мкс.
  3. Определите дрейфовый расход газа, используя разность давлений на входной воронке Р1 и выходной воронке Р2. Параллельная аккумуляционно-последовательная фрагментация (PASEF) происходит в клетке TIMS, накапливая все ионы-предшественники одновременно, а не по отдельности. Затем ионы-предшественники высвобождаются в узких ионных пиках по сравнению с обычно гораздо более широкими пиками (примерно в 50 раз короче), увеличивая отношение сигнал/шум, в то же время разделяя пептиды с соэюцией через подвижность14.
  4. Разработать метод LC-TIMS-ToF MS/MS для анализа пептидов протеолитических гистонов. Соедините высокопроизводительный жидкостный хроматограф (ВЭЖХ) со колонкой C18 (300 Å, 5 мкм, 4,6 мм x 250 мм) с коммерческим прибором TIMS-TOF MS с запатентованной технологией PASEF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот размер колонки был определен таким образом, чтобы обеспечить хорошее разделение пептидных смесей как при высоком, так и при низком pH, основываясь на ранее опубликованных работах 15,16,17.
    1. Установите объем впрыска 20 мкл (8 мкг) образца и расход 0,4 мл/мин.
    2. Запустите 60-минутный нелинейный градиент LC, используя воду с 0,1% муравьиной кислотой (растворитель A) и ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислотой (растворитель B). Установите градиент: 10% B в течение 2,7 мин, затем до 20% B через 5,3 мин, 28% B через 4 мин, 35% B еще через 18 мин, до 40% B через 13 мин и 100% B еще через 2 мин. После выдержки 100% B в течение 5 мин снизьте концентрацию до 10% B через 5 мин и удерживайте в течение последних 5 мин.
  5. Проверка элюирования образца из ВЭЖХ в TIMS-TOF с помощью ионизации наноэлектрораспылением (nESI) в режиме положительной ионизации.

4. Анализ данных

  1. Идентификация пептидных последовательностей и сайтов модификации.
    1. Подготовьте теоретический список пептидов с помощью программы ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] под инструментом MS-digest.
      1. Выполняйте теоретическое дигессия, принимая во внимание условия пищеварения (используемый фермент), типы искомых ПТМ (например, моно-, ди- или триметилирование), диапазон размеров искомых пептидов, а также диапазон обнаружения массы и потенциальное количество пропущенных расщеплений.
  2. Вручную проанализируйте полученные данные на основе теоретических пептидов (рис. 6)12.
    1. Поиск масс в нескольких состояниях заряда (от +1 до +4) для каждого теоретического пептида.
    2. После первоначальной идентификации каждого m/z выберите пик и подтвердите MS/MS, используя теоретический список ионов фрагментации, основанный на пептидной последовательности, включая PTM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если подвижность идентифицированного пептида была известна ранее, это также подтверждается.
  3. Рассчитайте относительную распространенность различных ПТМ и опишите каждую модификацию в процентах от указанной пептидной последовательности.
    1. Относительная распространенность каждого обнаруженного ПТМ вычисляется по следующему уравнению:
      Относительная распространенность = Площадь ПТМ / Общая площадь немодифицированных и ПТМ для данного пептида

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Восходящий протеомный рабочий процесс (рис. 7) обычно включает в себя следующее: экстракцию целевого белка (белков) из сырого образца с последующим количественным определением концентрации белка (белков) и последующим фракционированием, обычно с помощью гель-электрофореза или жидкостной хроматографии. После фракционирования белки переваривают с помощью протеолитического фермента (часто трипсина) и, наконец, масс-спектрометрический анализ полученных пептидов и идентификацию белков с использованием установленной базы данных18. Информация о последовательностях получена из ионов-предшественников в указанном диапазоне масс-зарядов (m/z), которые подвергаются диссоциации, индуцированной столкновением (CID), в результате чего образуются паттерны фрагментации, которые должны быть идентифицированы и секвенированы с помощью базы данных19 (рис. 8).

Основная цель этой работы заключалась в разработке и применении метода LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA, следуя шагам, описанным ранее в разделе протокола. Определение позиционности посттрансляционных модификаций изомерных и изобарических пептидов представляет особую проблему в отношении идентификации и интерпретации спектра. В этом исследовании в качестве образцов использовались рекомбинантные стандарты гистонов человека и клетки HeLa S3.

Гистонный PTM-анализ стандартов гистонов человека с помощью ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS позволил получить пептиды среднего и большого размера (длиной 3-30 аминокислот), обнаруженные с 5 зарядами на пептид. Процедура пропионилирования была успешной в получении более длинных и информативных пептидов, чем те, которые обычно образуются при триптическом пищеварении. При анализе данных были идентифицированы пептиды в различных модифицированных состояниях. Преимуществом метода на основе TIMS является дифференциация некоторых позиционных изомерных пептидов, несущих одни и те же ПТМ. Например, две изомерные частицы могут перекрываться по времени удержания и m/z; однако эти два сигнала могут быть разделены в области мобильности (рис. 9).

Соответствующие спектры фрагментации пептидов, показанные на рисунке 9 , были аннотированы с помощью программного обеспечения для протеомного анализа с использованием соответствующих файлов FASTA. На рисунке 9А виден немодифицированный пептид с тремя пропионильными (+56,03) группами (на N-конце, лизин 18 и лизин 23). На рисунке 9B пептид показан с ацетильной группой (+42,02) на лизине 18 и двумя пропионильными группами (одна на N-конце и одна на лизине 23). Наконец, на рисунке 9C пептид виден с ацетилированием, наблюдаемым на лизине 23 и двух пропионильных группах (на N-конце и лизине 18). Как было опубликовано ранее, преимущество PASEF может быть использовано для увеличения скорости и чувствительности секвенирования путем многократного нацеливания на одну и ту же функцию9. Это позволяет пользователю получить больше структурной информации из биологических образцов. В данном случае это относится к типу и положению ПТМ, встречающихся на каждом гистоне.

Анализ посттрансляционных модификаций также может быть представлен визуально в виде графика покрытия последовательности, как показано на рисунке 10. На рисунке 10А стандарт гистонов H3, который был пропионилирован перед расщеплением, содержит более длинные пептиды, чем в противном случае, обозначенные синими линиями. Гистоны, извлеченные из клеток HeLa S3, обрабатывали таким же образом, как показано на рисунке 10B. Было выявлено несколько ПТМ, включающих множество различных паттернов в одних и тех же аминокислотных позициях. Этого и следовало ожидать от биологических образцов. Следует отметить, что несколько серых линий на рисунке 10B обозначают пептиды, которые были идентифицированы неоднозначно из-за отсутствияMS2 в результате низкой интенсивности.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение и изготовление наконечников ступеней. (A-G) Пошаговое руководство по изготовлению наконечника ступени из кварцевого диска C18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обработка данных: 20210804 пропионилированных стандартных гистонов Mix_QC пептида. Прежде чем приступить к обработке данных, обязательно подготовьте теоретический список возможных зарядовых состояний и их фрагментаций (1550.9013; 775.9543; 517.6386; и т.д.) для извлечения этих значений из базовой пиковой хроматограммы (BPC + All MS). После извлечения каждого пептида убедитесь, что он выглядит так, как показано на рисунке. В качестве примера был выбран пик 775.9543. В правой части рисунка показаны три графика: первый соответствует хроматограмме (график зависимости интенсивности от времени), второй — мобилограмме и третий — масс-спектру с включенной фрагментацией PASEF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Шаги протокола timsControl 1-4. На рисунке показаны первые четыре шага процедуры timsControl. В левом верхнем углу нажмите кнопку Инструмент , чтобы включить или выключить соединение между прибором и программным обеспечением. Перед выполнением какой-либо задачи необходимо убедиться, что программное обеспечение находится в рабочем режиме. Наконец, проверьте правильность параметров TIMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Исходные параметры. В данном случае шприц Hamilton 500 мкл использовался только для TuneMix. Убедитесь, что остальные параметры остаются правильными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Иллюстрация 5: Калибровка соотношения массы к заряду (м/з). Выбирайте Калибровка до тех пор, пока не будет получено 100 % баллов в режиме калибровки на нижней левой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Калибровка подвижности. Выбирайте Калибровка до тех пор, пока не будет получено не менее 98,5 % в режиме калибровки на нижней левой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Типичный рабочий процесс восходящей протеомики. Пошаговые процедуры «снизу вверх» от пробоподготовки до идентификации9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Время удержания, изотопная структура и профили подвижности H3 18-26. (A) немодифицированный пропионилированный, (B) пептид K23Ac пропионилированный в двух других положениях и (C) K18Ac пропионилированный в двух других положениях. Обратите внимание на преимущества разделения подвижности для случая структурных изомеров, показанных на панелях B и C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Пример секвенирования фрагментационного пептида MS/MS с использованием PASEF. Спектры фрагментов были получены из программного обеспечения протеомного анализа пептида H3 с аминокислотными позициями 18-26. (A) немодифицированный пропионилированный, (B) пептид K23Ac пропионилированный в двух других положениях, и (C) K18Ac пропионилированный в двух других положениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Пример краткого обзора визуального анализа ПТМ гистонов. Результаты наблюдения пептидов и ПТМ из (A) стандарта H3 и (B) H3 из клеток HeLa S3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Характеристики стандартного пептида и пептида HeLa S3 LC-TIMS-ToF MS/MS. Список целевых и наблюдаемых пептидов, включая экспериментальные свойства (т.е. время удержания, m/z, 1/Ko и пиковые площади LC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Гистоны — это основные белки, которые регулируют структуру хроматина, взаимодействуя с ДНК в виде октамеров, состоящих из четырех основных гистонов (по два из H2A, H2B, H3 и H4)20. Гистоны содержат многочисленные остатки лизина и аргинина, которые легко модифицируются, что приводит к обширным ПТМ, которые изменяют химический состав хроматина, влияя на функцию гистонов или связываясь с другими клеточными белками21. ПТМ могут вызывать биологические реакции, работая в тандеме, при этом определенные группы ПТМ были зарегистрированы при нескольких заболеваниях, в частности, при нескольких типахрака.

Когда повреждение ДНК распознается на клеточном уровне, за ним немедленно следует действие сложного сигнального каскада, в котором отмечаются поражения, за которым следует координация прогрессии клеточного цикла и активация необходимых путей репарации. Кроме того, повреждение ДНК индуцирует различные модификации, такие как ацетильные и метильные аддукты, которые способствуют рекрутированию белка23. Большое разнообразие ПТМ, участвующих в повреждениях ДНК, приводит к вопросу о том, как эти молекулярные механизмы регулируют свое сосуществование и каково функциональное значение защиты целостности генома с помощью чрезвычайно сложной интегрированной сети. Например, триметилирование лизина 9 гистонов H3 (H3K9me3) было связано с различными патологиями при различных заболеваниях24. По таким причинам необходимо разработать инструментальные аналитические методики, позволяющие полностью охарактеризовать эти модификации на клеточном уровне23.

Анализ экстракции гистонов HeLa S3 с использованием программного обеспечения для ручного анализа данных и программного обеспечения для протеомного анализа выявил ПТМ, включая ацетилирование (+42,01 Да), метил-пропионилирование (+70,04 Да), диметилирование (+28,03 Да) и триметилирование (+42,05) для нескольких белков гистонов. Кроме того, метод MS/MS на основе PASEF позволил дифференцировать некоторые позиционные изомерные пептиды, несущие одни и те же PTM.

Во введении кратко описаны преимущества сопряжения LC-TIMS-ToF MS/MS при исследовании ПТМ, чтобы показать последние разработки ДДА с использованием параллельного накопления в ловушке подвижности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, индуцированной столкновением. Основная идея состоит в том, чтобы создать методологию, которая позволяет разрешать сигналы, поступающие от различных пептидов, и которую до сих пор не могли разрешить классические методы. Процесс дериватизации с использованием пропионового ангидрида предотвращает расщепление С-концев лизина трипсином, образуя более длинные и информативные пептиды. Пептиды с одинаковыми m/z и временем удержания были идентифицированы по характеру их фрагментации, но также было замечено, что некоторые из этих видов могут быть разделены в области подвижности с помощью метода LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS.

Чтобы лучше понять это, на рисунке 8 представлены три основные характеристики любой молекулы, что позволяет идентифицировать соединение, будь то интактные белки, липиды или пептиды (в данном случае гистон H3 18-26). Эти характеристики включают время удержания (мин) соединения в хроматографической колонке, отношение массы заряда (m/z) каждого соединения и подвижность (1/Ko), которую эти соединения проявляют при взаимодействии с дрейфующим газом. На рисунке 8А показано, что немодифицированный пептид H3 18-26 имеет RT 28,15 мин и что он имеет две полосы в спектре подвижности, что указывает на то, что он имеет, по крайней мере, две конформации, результат, который, как предполагается, является результатом двух лизинов (18 и 23), которые были пропионилированы в соответствии с ранее описанным протоколом. Следующие спектры (рис. 8B, C) показывают тот же пептид (H3 18-26), но изменяющий положение группы ацетилирования (42.02) между B, K18Ac и C, K23Ac. Эти два изомера (K18Ac и K23Ac) были идентифицированы с помощью мобилограммы, поскольку они имеют разное пространственное распределение, что приводит к различным взаимодействиям с газом в ячейке TIMS. Важность этого метода заключается в возможности более детального выявления и изучения различных ПТМ, которые были связаны с различными заболеваниями, например, через повреждение ДНК.

Когда данные о фрагментации разрежены, идентификация модификации в конкретном остатке является сложной задачей, поскольку две или более разнородных модификации могут происходить одновременно на одном и том же остатке (или рядом с ним) и могут быть поняты как одна модификация25. Эту проблему можно решить, убедившись, что немодифицированный пептид идентифицирован, в частности, используя стандарт для подтверждения или опровержения наличия одной модификации, а не нескольких модификаций (Таблица 1).

Чтобы избежать чрезмерного загрязнения или экстракции нечистых гистонов, важно проверить качество реагентов перед использованием. Например, если буферный раствор NIB хранится и используется в больших количествах, убедитесь, что раствор прозрачный, без внешних признаков мутности или аномального внешнего вида. Мутность может быть результатом роста бактерий, которые загрязняют образцы и могут привести к образованию смеси гистонов и бактериальных белков. Кроме того, рекомендуется подготовить новые калибровочные кривые для анализов, таких как BCA или анализ Брэдфорда, используемый для определения концентрации белка, гарантируя, что белок, используемый для калибровочной кривой, не истек и не деградировал.

Этот метод можно распространить и на другие типы клеток или организмов, например, комаров. В случае целых или частичных организмов выбор соответствующего количества организмов особенно важен для обеспечения того, чтобы конечная концентрация гистонов подходила для анализа.

Кроме того, в качестве общей рекомендации по техническому обслуживанию масс-спектрометра необходимо периодически очищать переднюю часть, чтобы предотвратить образование отложений на приборе и загрязнение между прогонами. Эта очистка должна включать в себя занавеску, диафрагму и квадруполь, если это необходимо.

Как правило, при использовании ЖХ необходимо учитывать возможность еженедельной подготовки свежих подвижных фаз (фаз) с использованием растворителей MS-класса. Хорошей практикой является наличие специальных пипеток и стеклянной посуды для подготовки подвижной фазы и продувки линий LC всякий раз, когда в систему помещаются новые растворы. Защитные и разделительные колонны обычно следует заменять каждые 100-200 инъекций и 500-1500 инъекций соответственно26. Обязательно вводите заготовки до и после запуска партии образцов. Если в данном пакете имеется большое количество образцов, можно также рассмотреть возможность запуска заготовки через различные промежутки времени в пакете.

Протокол обеспечивает рабочий процесс DDA на основе PASEF для обнаружения гистоновых PTM и дифференциации изобарических и изомерных частиц на основе подвижности ионов.

Этот протокол требует тщательной пробоподготовки, и необходимо учитывать общее время подготовки экспериментальных образцов. В среднем, протокол пробоподготовки занимает 2-3 рабочих дня. Кроме того, различия между лабораториями и версиями приборов могут повлиять на общую чувствительность анализа.

Очень немногие программы для анализа протеомных данных были признаны адекватными для использования при анализе гистонов методами «снизу вверх» без ручной настройки или коррекции 27,28,29. Результаты должны быть подтверждены (по крайней мере, на первых порах) с помощью ручного анализа, который также отнимает много времени. Если используется аналитическое программное обеспечение, оно должно иметь возможности аннотирования MS/MS, которые, как правило, легко подтвердить или отклонить.

Стоит также отметить, что невозможно разделить изомеры с помощью масс-спектрометрии, если не вставлена ячейка TIMS и не используются значения подвижности; Например, положение модификаций гистонов может быть определено с помощью паттернов фрагментации (PASEF).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мелвин А. Парк (Melvin A. Park) и Мэтью Уиллетс (Matthew Willetts) являются сотрудниками компании Bruker Daltonics Inc., производителя инструмента timsTOF.

Acknowledgments

Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом в рамках гранта No. HRD-1547798 и Grant No. HRD-2111661. Эти гранты NSF были присуждены Международному университету Флориды в рамках программы Центров передового опыта исследований в области науки и технологий (CREST). Это вклад под номером 1672 от Института окружающей среды, выдающейся программы при Международном университете Флориды. Дополнительная поддержка была оказана Национальным институтом здравоохранения в рамках гранта No. R21AI135469 Франсиско Фернандес-Лима и Грант No. R01HD106051 Бенджамину А. Гарсиа, а также Национальным научным фондом в рамках гранта No. CHE-2127882 Бенджамину А. Гарсиа. Авторы выражают признательность доктору Марио Гомесу Эрнандесу за первоначальную поддержку во время разработки метода.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060710 Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-282-300 Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060100 Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40 Thermo Fisher Scientific 28324 NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ (Mediatech) MT21031CM
15 mL Conical Tubes Corning 352196 Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 02-707-138 Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060310 Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737 Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes Corning 352070 Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate Thermo Fisher Scientific 12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL Axygen P-DW-500-C-S
Acetone Sigma Aldrich 179124 ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN) Thermo Fisher Scientific A998 HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS120 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF Thermo Fisher Scientific 328110500 AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 Sigma Aldrich 09830 BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH Sigma Aldrich AX1303 Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar) Airgas AR HP 300
BEH C18 HPLC column Waters 186003625 XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2 Sigma Aldrich C4901 Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer Thermo Fisher Scientific 13151014
Ceramic scoring wafer Restek 20116
Compass DataAnalysis 6.0 Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2 Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1 Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 89237526
Disposable Cell Lifters Thermo Fisher Scientific  08100240 Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-363 Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific P2325 1 M
Formic acid (FA) Sigma Aldrich 695076 ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD (Molex (Polymicro) TSP075375
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38S Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes Sigma Aldrich BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph  Shimadzu Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl Sigma Aldrich 258148 ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å Thermo Fisher Scientific 60106-402
Hypersep cartridge Thermo Fisher Scientific 60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF Agilent G1969-85000 TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC Thermo Fisher Scientific A454 Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube Adapters GL Sciences 501021514
Microcystin Thermo Fisher Scientific 50-200-8727 Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm LEAP PAL Parts LAP.11190933
Nanodrop Thermo Fisher Scientific model: ND3300
Nitrogen (N2) Airgas NI UHP300
PEAKS Studio X+ Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek Micro Essential Lab JR-113 Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl Sigma Aldrich P3911 ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell Next Advance  model: PC77
Propionic Anhydride Sigma Aldrich 8.00608 For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) NuAire, model: Nuwind NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g ESI Source Solutions r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels Bio-Rad 4569035 Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate Thermo Fisher Scientific A11079.06 98+%
Sodium chloride, NaCl Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18 VWR 76333-134 Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor Savant model: SC210A
Sucrose Millipore 1.07651 suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4  Sigma Aldrich 339741 99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer Bruker Daltonics model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA Sigma Aldrich T0699 6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich 302031 Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate Advion model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057
Tube rotator Thermo Fisher Scientific 88881001
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS118 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Tags

Химия выпуск 203
Скрининг модификации гистонов с использованием жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N.,… More

Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N., Valadares Tose, L., Willetts, M., Park, M. A., Bhanu, N. V., Garcia, B. A., Fernandez-Lima, F. Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (203), e65589, doi:10.3791/65589 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter