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Chemistry

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65589
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Summary

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Abstract

Les protéines d’histones sont très abondantes et conservées chez les eucaryotes et jouent un rôle important dans la régulation des gènes grâce à des structures connues sous le nom de modifications post-traductionnelles (PTM). L’identification de la position et de la nature de chaque PTM ou modèle de PTM par rapport à des facteurs externes ou génétiques permet de corréler statistiquement cette information avec des réponses biologiques telles que la transcription, la réplication ou la réparation de l’ADN. Dans le présent travail, un protocole analytique à haut débit pour la détection des PTM d’histones à partir d’échantillons biologiques est décrit. L’utilisation de la chromatographie liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) permet de séparer et d’attribuer PTM les modifications les plus pertinentes sur le plan biologique en une seule analyse. L’approche décrite tire parti des développements récents de l’acquisition de données dépendantes (DDA) en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité, suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. Les PTM d’Histones sont attribués en toute confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.

Introduction

Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est emballé sous forme de chromatine dans des unités fonctionnelles appelées nucléosomes. Ces unités sont composées d’un octamère de quatre histones centrales (deux de chacune des catégories H2A, H2B, H3 et H4)1,2,3,4. Les histones sont parmi les protéines les plus abondantes et les mieux conservées chez les eucaryotes, qui sont en grande partie responsables de la régulation des gènes5. Les modifications post-traductionnelles des histones (PTM) jouent un rôle important dans la régulation de la dynamique de la chromatine et truquent divers processus biologiques tels que la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN6. Les PTM se produisent principalement sur la surface accessible des régions N-terminales des histones qui sont en contact avec l’ADN 3,7. Cependant, les modifications de la queue et du noyau influencent la structure de la chromatine, modifiant les interactions internucléosomiques et recrutant des protéines spécifiques 3,8.

Un défi actuel de la protéomique basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est la coélution potentielle d’analytes d’intérêt. Dans le cas des analyses dépendantes des données (DDA), cela se traduit par la perte potentielle de plusieurs ions précurseurs au cours du processus d’acquisition MS/MS9. Les instruments à temps de vol (ToF) acquièrent des spectres à très haute fréquence 9,10 (jusqu’à des dizaines de kHz)11 ; cela les rend capables de balayer rapidement les ions précurseurs totaux dans un échantillon complexe (MS1), promettant ainsi une sensibilité et des taux de séquençage MS/MS optimaux (jusqu’à 100 Hz)9 et les rendant idéaux pour l’analyse d’échantillons biologiques10. Néanmoins, la sensibilité disponible à ces vitesses de balayage élevées est limitée par le taux MS/MS9. L’ajout de la spectrométrie de mobilité des ions piégés (TIMS) en combinaison avec un spectromètre de masse orthogonal quadripolaire à temps de vol (qToF) a été utilisé pour atténuer ces limitations. Dans TIMS, tous les ions précurseurs sont accumulés en tandem et élués en fonction de leur mobilité, plutôt que de sélectionner des masses précurseurs uniques avec unquadripôle 9. La fragmentation en série par accumulation parallèle (PASEF) permet des centaines d’événements MS/MS par seconde sans aucune perte de sensibilité9.

L’objectif principal de ce travail était de montrer les développements récents de la DDA en utilisant une accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par collision (CID). Les PTM d’Histones ont été attribués en toute confiance en fonction de leurs temps de rétention (RT), de leurs mobilités et de leurs modèles de fragmentation.

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Protocol

REMARQUE : Les échantillons d’histones ont été extraits à l’aide d’une méthode adaptée de Bhanu et al. (2020)12.

1. Préparation des échantillons

  1. Récolte de cellules cultivées
    1. Lorsque les cellules sont confluentes à 80 %, assurez-vous qu’elles sont viables en excluant le bleu trypan.
      REMARQUE : Une lignée cellulaire HeLa S3 a été utilisée pour ces expériences, mais cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cellule cultivée.
    2. Aspirer le milieu, puis appliquer 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur chaque plaque.
    3. Faites tourner la ou les plaques pour rincer tous les résidus de milieu, puis aspirez le PBS et appliquez 5 mL de 1x PBS.
    4. Séparez délicatement les cellules de la plaque en les grattant avec un lève-cellule jetable.
    5. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
    6. Granuler les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 5 min.
    7. Aspirez le PBS de la pastille cellulaire.
    8. Procédez à l’extraction des histones.
      REMARQUE : Congelez rapidement la pastille de cellule dans de l’azote liquide si elle ne peut pas être traitée immédiatement. Conservez les granulés à -80 °C jusqu’au moment de continuer.
  2. Extraction d’histones
    1. Estimez le volume de chaque pastille cellulaire et marquez le ménisque avec un marqueur permanent.
    2. Préparez suffisamment de tampon d’isolement nucléaire (NIB ; 15 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM de NaCl, 60 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 et 250 mM de saccharose) pour tous les échantillons. Alternativement, si de nombreux échantillons doivent être traités au fil du temps, préparez le tampon en vrac et stockez-le à 2-8 °C jusqu’à 6 mois, ou aliquotez-le et congelez-le indéfiniment à -15 °C à -25 °C en décongelant uniquement la quantité nécessaire pour chaque extraction.
      REMARQUE : La mémoire tampon doit rester dégagée pendant le stockage. Si le tampon prend un aspect trouble ou anormal à tout moment, jetez-le et préparez un nouveau tampon.
    3. Préparer 50 fois le volume des pastilles cellulaires du tampon de lavage et ajouter les inhibiteurs comme suit (environ 10 ml de tampon de lavage pour 2 échantillons).
      1. Pour préparer 10 mL de tampon de lavage, mélanger 10 mL de NIB, 30 μL de 200 mM de chlorhydrate de fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle [AEBSF], 10 μL de 1 M de dithiothréitol [DTT], 20 μL de microcystine 5 μM, 20 μL de 5 M de butyrate de sodium.
    4. Retirez 1/5 du tampon de lavage pour préparer le tampon de lyse (1/5 du volume du tampon de lavage, 0,3 % de NP-40 ou NP-40).
      REMARQUE : N’utilisez pas Triton-X 100 à la place du NP-40 ou de l’alternative NP-40, car il peut être trop abrasif pour certains types de cellules.
    5. Lavez soigneusement la pastille cellulaire en la suspendant dans 5 colonnes de tampon de lavage et en la centrifugant à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Effectuez cette étape deux fois, en aspirant et en jetant le surnageant entre les lavages.
    6. Assurez-vous que le volume de la pastille de cellule est toujours marqué avec un marqueur permanent. Remettre en suspension dans 10 volumes de tampon de lyse.
    7. Mélangez soigneusement chaque pastille à la pipette pour la remettre en suspension, puis incubez pendant 15 minutes sur de la glace.
    8. Après 15 min, centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C.
    9. Aspirer et jeter le surnageant.
      REMARQUE : Le plomb doit réduire à ≤ 1/2 la taille du plomb d’origine (comme indiqué par la ligne de marqueur). Si la pastille n’a pas suffisamment réduit, répétez la procédure de lyse et incluez une étape d’homogénéisation douce à l’aide d’un pilon pour ouvrir les cellules.
    10. Une fois la lyse terminée, remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de lavage, puis centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez et jetez le surnageant, puis répétez l’étape de lavage une fois de plus pour éliminer toute trace de NP-40.
      REMARQUE : À ce stade, la pastille est constituée de chromatine, qui contient des histones.
    11. Remettre le granulé en suspension dans 5 volumes (de la taille de la pastille cellulaire d’origine) de 0,4 N H2SO4.
    12. Incuber pendant 2 h dans une chambre froide ou un réfrigérateur à l’aide d’un agitateur.
    13. Après 2 h, centrifuger le ou les échantillons à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C. Ne jetez pas le surnageant.
    14. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes et augmentez l’acide trichloracétique (TCA) à 100 % pour atteindre 1/3 du volume du contenu (la concentration finale de TCA sera d’environ 20 %).
    15. Retournez doucement le tube et observez que la solution claire et incolore devient blanche et/ou trouble, indiquant une précipitation de protéines.
      REMARQUE : Pour les solutions à faible concentration d’histones, la précipitation des protéines peut ne pas être immédiatement perceptible, mais le précipité doit être visible après l’incubation pendant la nuit.
    16. Incuber sans perturbation pendant la nuit (12-18 h) à 4 °C pour précipiter complètement les protéines des histones.
    17. Le lendemain, centrifuger à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C.
    18. Aspirer le surnageant en faisant attention de ne pas toucher les côtés du tube avec la pointe de la pipette. À ce stade, les histones sont déposées principalement sous forme de film sur les côtés du ou des tubes.
    19. Ajouter 500 μL d’acétone glacée + 0,1 % de HCl (acétone acide) dans chaque tube, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, puis retourner doucement le(s) tube(s) plusieurs fois. Disposez les échantillons dans l’ordre (1, 2, 3, etc.) en faisant cela, car toute acétone errante peut enlever les marques sur les tubes. Centrifuger à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C et décanter doucement le surnageant.
    20. Répétez cette étape de rinçage avec 500 μL d’acétone 100 % glacée, également avec une pipette Pasteur en verre. Centrifuger à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C et décanter doucement le surnageant.
    21. Laissez les tubes sécher à température ambiante jusqu’à ce que l’acétone restante se soit évaporée.
    22. Une fois sec, ajoutez 100 μL d’eau de qualité spectrométrie de masse (MS) dans chaque tube. Utilisez cette gouttelette pour écouvillonner tous les côtés du récipient afin de remettre en suspension l’ensemble du film d’histones. Pour ce faire, pipetez la gouttelette sur le côté du tube et faites-la tourner tout en pipetant de haut en bas ou en distribuant la moitié des 100 μL et en utilisant la pointe pour la remuer tout autour. Une combinaison des deux méthodes fonctionne mieux. Les histones sont facilement solubles dans l’eau et seront dans la solution.
    23. Après avoir remis tous les échantillons en suspension, s’il reste du solide blanc, sonicer dans un bain à température ambiante pendant 5 min.
    24. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer la solution claire dans des tubes frais. Jeter toute pastille insoluble restante.
    25. Exécutez une SDS-PAGE dans des conditions réductrices pour vérifier que l’extraction est propre.
      REMARQUE : Les gels peuvent être utilisés en utilisant n’importe quelle concentration appropriée de polyacrylamide tant qu’il peut différencier les protéines dans la gamme de 10 à 20 kDa. Voir le tableau des matériaux pour les gels utilisés dans ce protocole.
    26. Effectuer un test de concentration de protéines (c.-à-d. Bradford ou BCA) pour déterminer la concentration totale de protéines.
  3. Dérivation chimique (propionylation) des résidus de lysine
    1. Transférez 20 μg d’histones (déterminées par le dosage des protéines) dans un tube propre. Sécher cet échantillon à <5 μL à l’aide d’un concentrateur sous vide, puis remettre en suspension avec 20 μL de bicarbonate d’ammonium à 100 mM (NH4CO3) (~1 μg/μL de solution). Ajustez le pH à ~8 en utilisant de l’hydroxyde d’ammonium si nécessaire.
      ATTENTION : N’utilisez pas d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) pour remettre en suspension, uniquement pour ajuster le pH si nécessaire. Sinon, les protéines se dénatureront et précipiteront.
      REMARQUE : Pour vérifier le pH avec une perte d’échantillon minimale, utilisez une pointe de pipette pour tremper l’échantillon et tamponnez sur une bandelette de pH. Cette procédure de test sera utile tout au long des étapes restantes de la préparation des échantillons.
    2. Préparez le réactif de propionation en ajoutant de l’anhydride propionique à l’acétonitrile (ACN) dans un rapport de 1 :3 (v/v) (c.-à-d. pour obtenir 40 μL de réactif, combinez 10 μL d’anhydride propionique avec 30 μL d’ACN).
      REMARQUE : Traditionnellement, le méthanol ou l’isopropanol ont été utilisés dans la préparation d’un réactif de propionylation. Comme la propionylation est une réaction de formation d’amides, un solvant non protonique, comme l’acétonitrile, est nécessaire pour prévenir les produits secondaires et les réactions indésirables, tels que l’ester méthylpropionylique, qui résulte de l’utilisation du méthanol. Ne préparez suffisamment de réactif de propionylation que pour un maximum de 4 échantillons à la fois afin que le réactif reste frais. Utilisez le réactif dans les 1 à 2 minutes suivant la préparation. Au fur et à mesure que le réactif repose, l’anhydride propionique réagit avec l’humidité ambiante et l’acide acétique commence à se former, ce qui peut modifier l’efficacité du réactif et modifier le pH de la solution d’histones une fois le réactif ajouté.
    3. Ajouter le réactif de propionylation à chaque échantillon dans un 1 :4 (v/v) (c.-à-d. pour 20 μL d’histones, ajouter 5 μL de réactif de propionylation).
    4. Ajouter rapidement 1 :5 (v/v) NH4OH (c.-à-d. ajouter 4 μL pour 20 μL de solution d’histones) pour rétablir le pH de la solution à ~8. Si le pH est encore trop bas, ajoutez 1 à 2 μL de NH4OH à la fois jusqu’à ce qu’un pH de 8 soit atteint. En règle générale, un rapport de 1 :5 (v/v) est suffisant.
    5. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min sans perturbation.
    6. Répétez la réaction de propionylation pour un maximum de 3 à 4 échantillons par lot de réactif de propionylation afin d’assurer une formation minimale d’acide.
    7. Répétez les étapes 1.3.2 à 1.3.5 de la procédure de propionylation. Un deuxième cycle de propionylation garantit que >95 % des lysines disponibles sont dérivées.
    8. Sécher les échantillons à <5 μL à l’aide d’un concentrateur sous vide. Cela évaporera tout réactif de proponylation n’ayant pas réagi, les produits acides et l’ammoniac gazeux libérés par le NH4OH. Si les échantillons sèchent complètement, ce n’est pas grave, car il n’y a pas de pertes d’échantillons significatives.
      REMARQUE : Déplacer l’air dans la bouteille d’anhydride propionique avec du gaz argon avant le stockage pour éviter la formation d’acide acétique due au contact de l’humidité ambiante restant dans la bouteille.
  4. Digestion protéolytique à la trypsine
    1. Remettre en suspension les histones dans 100 mM de NH4HCO3 pour obtenir un volume de 20 μL, atteignant une concentration optimale de 1 μg/μL.
      REMARQUE : Les solutions d’échantillons avec des concentrations inférieures à 1 μg/μL entraîneront une diminution de l’efficacité de la trypsine.
    2. Ajouter de la trypsine aux échantillons d’histones dans un rapport de 1 :10 (poids/poids) (c.-à-d. ajouter 2 μL de solution de trypsine à 1 μg/μL à 20 μg d’histones).
    3. Incuber les réactions à 37 °C pendant 6 à 8 h. Vous pouvez également incuber pendant une nuit (12 à 18 h) à température ambiante.
    4. Arrêter la digestion en congelant à -80 °C pendant au moins 1 h.
      REMARQUE : N’utilisez pas d’acide pour éteindre la réaction de digestion, car cela provoquerait une baisse indésirable du pH à ce stade de la procédure. L’échantillon peut être stocké à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à partir (point d’arrêt intermédiaire).
  5. Dérivation chimique (propionylation) de N-terminaux peptidiques
    1. Sécher les échantillons à <5 μL à l’aide d’un concentrateur sous vide.
    2. Remettre les échantillons en suspension jusqu’à 20 μL (1 μg/μL) en utilisant 100 mM de NH4HCO3.
    3. Répétez la propionylation comme précédemment (étape 1.3).
      REMARQUE : Il est normal que les échantillons mettent plus de temps à sécher à cette étape en raison d’un rapport phase aqueuse/organique plus élevé.
  6. Dessalage d’échantillons avec des pointes de scène
    1. Mettre les échantillons en suspension ou diluer avec 50 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % d’AGT.
    2. À l’aide d’un carottier d’échantillon 11-G, perforez 5 disques de matériau C18 à partir d’un disque d’extraction en phase solide (perforez les 5 disques avant de les transférer à la pointe de la pipette). Insérez et assurez-vous que les disques sont solidement et uniformément calés au bas d’une pointe de pipette de 200 μL (Figure 1).
      REMARQUE : Utiliser un carottier de 15 g si vous dessalez plus de 25 μg d’échantillon à travers une pointe à un étage.
    3. Utilisez un adaptateur de centrifugeuse pour maintenir les pointes de la platine en place dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml ou 2 ml.
      REMARQUE : Pour les étapes de centrifugation suivantes, utiliser une révolution lente (400-500 x g) à 4 °C, pendant 1 à 2 minutes à la fois ; les solvants traversent normalement la résine en moins de 1 minute, selon le degré d’étanchéité du matériau C18 dans les pointes.
    4. Rincer la résine par centrifugation avec 50 μL d’acétonitrile à 100 % pour activer le matériauC18 et éliminer les contaminants potentiels.
      REMARQUE : Il peut être plus facile de charger des solutions sur les pointes de la platine à l’aide des pointes de pipette à chargement de gel. Une fois le matériau C18 activé, il est important de ne pas laisser la résine sécher pendant la durée de la procédure de dessalage.
    5. Équilibrer le matériau du disque avec 80 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % d’AGT par centrifugation.
    6. Acidifiez l’échantillon à pH 4 ou moins à l’aide d’acide acétique glacial. Vérifiez le pH avec des bandelettes de pH comme avant pour minimiser la perte d’échantillon.
    7. Chargez l’intégralité de l’échantillon sur le disque de résine par centrifugation lente.
    8. Laver l’échantillon avec 80 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % de TFA par centrifugation.
    9. Éluer l’échantillon dans un tube propre de 1,5 mL en rinçant 70 μL d’acétonitrile à 75 % et d’acide acétique à 0,5 % par centrifugation lente. Un temps de centrifugation supplémentaire peut être utilisé pour s’assurer que le volume d’échantillon complet est élué de la pointe de la scène. Il n’y a pas de problème si la résine sèche avec le temps de centrifugation supplémentaire, car elle n’est plus nécessaire après l’élution de l’échantillon.
    10. Séchez complètement chaque échantillon dans un concentrateur sous vide.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à continuer (point d’arrêt provisoire).
    11. Pour l’analyse LC-MS/MS, reconstituer les échantillons dans un volume de solvant A (acide formique à 0,1 %) du protocole de chromatographie en phase liquide (LC) qui donne la concentration finale de 0,4 μg/μL (c.-à-d. dissoudre 20 μg d’histones dans 50 μL de solvant A).

2. Interface du logiciel TIMS

  1. Sélectionnez l’onglet Instrument et passez à Operate (vérifiez que le nom de l’instrument est surligné en vert) (Figure 2).
  2. Vérifiez les paramètres TIMS (Figure 2).
  3. Vérifiez les paramètres MS (début de la numérisation, fin de la numérisation, polarité ionique, mode de numérisation) (Figure 2).
  4. Vérifiez les paramètres TIMS (mode, début de la mobilité, fin de la mobilité, temps de rampe, temps d’accumulation, cycle de service, taux de rampe, taux MS, moyenne MS et autocalibration) (Figure 2).
  5. Accédez à l’onglet Source et activez l’option seringue (Hamilton 500 μL) uniquement pour l’étape d’étalonnage TuneMix (Figure 3)13.
  6. Accédez à l’onglet Calibration , cliquez sur m/z, sélectionnez Mode d’étalonnage et choisissez le mode (Enhanced Q, généralement), zoomez (+0,01 %) STD Dev (0,24) et cliquez sur Calibrate ; lorsqu’un score de 100 % est atteint, accepter (Figure 4).
  7. Allez dans l’onglet mobilité et répétez le processus de calibrage (mode linéaire, généralement), la plage de détection (+5%), la largeur (0,1 Da), le développement standard (0,1855), puis cliquez sur calibrer ; lorsque vous obtenez un score ≥ 98,5 %, acceptez (figure 5).
  8. Accédez à la méthode et sélectionnez la méthode à utiliser ; pour cet exemple, Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl a été sélectionné (Figure 5).

3. LC-TIMS-PASEF-TOF MS/MS

  1. Utilisez les conditions de fonctionnement typiques de nESI : tension capillaire de 4500 V, décalage de la plaque d’extrémité de 800 V, pression de nébulisation de 3,0 bars, gaz sec de 10,0 L/min, chauffage sec de 200 °C et débit d’injection de 50 μL/min.
  2. Utilisez les paramètres MS typiques : énergie de collision de 6 eV, RF de collision de 1200 Vpp, temps de transfert de 75 μs, stockage de préimpulsions de 5 μs.
  3. Déterminez le débit de gaz de dérive en utilisant la différence de pression entre l’entonnoir d’entrée P1 et l’entonnoir de sortie P2. L’accumulation parallèle et la fragmentation en série (PASEF) se produisent dans la cellule TIMS, accumulant tous les ions précurseurs simultanément plutôt qu’individuellement. Les ions précurseurs sont ensuite libérés en pics d’ions étroits par rapport aux pics normalement beaucoup plus larges (environ 50 fois plus courts), ce qui augmente le rapport signal/bruit tout en séparant les peptides co-élués via la mobilité14.
  4. Développer une méthode LC-TIMS-ToF MS/MS pour analyser les peptides d’histones protéolytiques. Couplez un chromatographe liquide haute performance (HPLC) équipé d’une colonne C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) avec un instrument commercial TIMS-TOF MS doté de la technologie exclusive PASEF.
    NOTE : Cette taille de colonne a été déterminée pour fournir une bonne séparation à pH élevé et faible pour les mélanges peptidiques, sur la base de travaux publiés précédemment 15,16,17.
    1. Régler le volume d’injection à 20 μL (8 μg) d’échantillon et un débit de 0,4 mL/min.
    2. Exécutez un gradient de LC non linéaire de 60 minutes en utilisant de l’eau contenant de l’acide formique à 0,1 % (solvant A) et de l’acétonitrile contenant de l’acide formique à 0,1 % (solvant B). Réglez la pente : 10 % B pendant 2,7 min, puis à 20 % B en 5,3 min, 28 % B en 4 min, 35 % B en 18 min supplémentaires, à 40 % B en 13 min et 100 % B en 2 min supplémentaires. Après avoir maintenu 100 % B pendant 5 minutes, abaissez la concentration à 10 % B pendant 5 minutes et maintenez pendant les 5 dernières minutes.
  5. Vérifier l’élution de l’échantillon de la HPLC dans le TIMS-TOF via l’ionisation par nano-électronébulisation (nESI) en mode d’ionisation positive.

4. Analyse des données

  1. Identifier les séquences peptidiques et les sites de modification.
    1. Préparez une liste théorique de peptides à l’aide de ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] sous l’outil MS-digest.
      1. Effectuer une digestion théorique en tenant compte des conditions de la digestion (enzyme utilisée), des types de PTM recherchés (par exemple, mono-, di- ou triméthylation), de la gamme de tailles des peptides recherchés, ainsi que de la plage de détection de masse et du nombre potentiel de clivages manqués.
  2. Analyser manuellement les données acquises sur la base de peptides théoriques (Figure 6)12.
    1. Recherche des masses à plusieurs états de charge (+1 à +4) pour chaque peptide théorique.
    2. Après l’identification initiale de chaque m/z, sélectionnez le pic et confirmez la MS/MS à l’aide d’une liste théorique d’ions de fragmentation basée sur la séquence peptidique, y compris les PTM.
      REMARQUE : Si la mobilité du peptide identifié était connue auparavant, cela est également confirmé.
  3. Calculez les abondances relatives des différents PTM et rapportez chaque modification en pourcentage de la séquence peptidique spécifiée.
    1. L’abondance relative de chaque PTM détectée est calculée à l’aide de l’équation suivante :
      Abondance relative = Superficie de PTM/Superficie totale de PTM non modifiés et PTM pour un peptide donné

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Representative Results

Un flux de travail protéomique ascendant (Figure 7) implique généralement les éléments suivants : extraction de la ou des protéines cibles à partir d’un échantillon brut, suivie de la quantification de la concentration de la ou des protéines, puis fractionnement, généralement par électrophorèse sur gel ou chromatographie liquide. Après fractionnement, les protéines sont digérées à l’aide d’une enzyme protéolytique (souvent la trypsine), et enfin, analyse spectrométrique de masse des peptides résultants et identification des protéines à l’aide d’une base de données établie18. Les informations de séquence sont dérivées d’ions précurseurs dans la gamme masse/charge (m/z) indiquée, qui sont soumis à une dissociation induite par collision (CID), produisant des modèles de fragmentation à identifier et à séquencer à l’aide d’une base de données19 (Figure 8).

Pour ce travail, l’objectif principal était de développer et d’appliquer une méthode LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA en suivant les étapes décrites précédemment dans la section protocole. La détermination de la positionnalité des modifications post-traductionnelles sur les peptides isomères et isobares a présenté un défi particulier en termes d’identification et d’interprétation du spectre. Dans cette étude, des étalons d’histones humains recombinants et des cellules HeLa S3 ont été utilisés comme échantillons.

L’analyse PTM des histones humaines par ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS a donné des peptides de taille moyenne à grande (3 à 30 acides aminés de longueur) détectés avec jusqu’à 5 charges par peptide. La procédure de propionylation a permis de produire des peptides plus longs et plus informatifs que ceux couramment produits par digestion tryptique. Lors de l’analyse des données, les peptides ont été identifiés dans divers états modifiés. Comme avantage, la méthode basée sur TIMS a différencié certains peptides isomériques positionnels portant les mêmes PTM. Par exemple, deux espèces isomères peuvent se chevaucher en termes de temps de rétention et de m/z ; cependant, les deux signaux pourraient être séparés dans le domaine de la mobilité (Figure 9).

Les spectres de fragmentation correspondants pour les peptides illustrés à la figure 9 ont été annotés par un logiciel d’analyse protéomique à l’aide des fichiers FASTA appropriés. Sur la figure 9A, le peptide non modifié est vu avec trois groupes propionyle (+56,03) (sur la N-terminale, la lysine 18 et la lysine 23). Sur la figure 9B, le peptide est observé avec un groupe acétyle (+42,02) sur la lysine 18 et deux groupes propionyle (un à la N-terminale et un sur la lysine 23). Enfin, sur la figure 9C le peptide est vu avec une acétylation observée sur la lysine 23 et deux groupes propionyle (sur la N-terminale et la lysine 18). Comme publié précédemment, l’avantage PASEF pourrait être utilisé pour augmenter la vitesse et la sensibilité du séquençage en ciblant la même caractéristique à plusieurs reprises9. Cela permet à l’utilisateur d’obtenir plus d’informations structurelles à partir d’échantillons biologiques. Dans ce cas, cela s’applique au type et à la position des PTM présents sur chaque histone.

L’analyse des modifications post-traductionnelles peut également être représentée visuellement sous la forme d’un tracé de couverture de séquence, comme le montre la figure 10. Dans la figure 10A, l’étalon H3 de l’histone qui a été propionylé avant la digestion présente des peptides plus longs que ceux qui auraient autrement résulté, indiqués par les lignes bleues. Les histones extraites des cellules HeLa S3 ont été traitées de la même manière, comme le montre la figure 10B. Plusieurs PTM ont été indiqués, y compris de nombreux motifs différents aux mêmes positions d’acides aminés. Il faut s’y attendre à partir d’échantillons biologiques. Il convient de noter que les quelques lignes grises de la figure 10B désignent des peptides qui ont été identifiés de manière ambiguë en raison de l’absence d’un MS2 résultant de la faible intensité.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique et production des pointes de platine. (A-G) Guide étape par étape sur la fabrication d’une pointe de disque de silice en C18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Traitement des données : 20210804 Histones standard propionylées Mix_QC Peptide. Avant de commencer à traiter les données, assurez-vous de préparer la liste théorique des états de charge possibles et de leurs fragmentations (1550.9013 ; 775.9543 ; 517.6386 ; etc.) pour extraire ces valeurs du chromatogramme à pic de base (BPC + All MS). Après avoir extrait chaque peptide, assurez-vous qu’il ressemble à la liste d’analyse indiquée sur la figure. Le pic 775,9543 a été choisi comme exemple. Sur le côté droit de la figure, trois graphiques sont représentés : le premier correspond au chromatogramme (graphique d’intensité en fonction du temps), le deuxième au mobilogramme, et le troisième au spectre de masse avec fragmentation PASEF incluse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : étapes 1 à 4 du protocole timsControl. La figure montre les quatre premières étapes de la procédure timsControl. En haut à gauche, cliquez sur le bouton Instrument pour activer et désactiver la connexion entre l’instrument et le logiciel. Avant d’exécuter une tâche, il faut s’assurer que le logiciel est en mode de fonctionnement. Enfin, vérifiez que les paramètres TIMS sont corrects. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Paramètres de la source. Dans ce cas, la seringue Hamilton 500 μL n’a été utilisée que pour TuneMix. Vérifiez que les autres paramètres restent corrects. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Étalonnage masse/charge (m/z). Sélectionnez Calibrer jusqu’à ce qu’un score de 100 % ait été obtenu dans le panneau inférieur gauche Mode d’étalonnage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Calibrage de la mobilité. Sélectionnez Calibrer jusqu’à ce qu’un score d’au moins 98,5 % ait été obtenu dans le panneau inférieur gauche Mode d’étalonnage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Flux de travail protéomique ascendant typique. Étapes par étapes des procédures ascendantes, de la préparation des échantillons à l’identification9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Temps de rétention, profil isotopique et profils de mobilité H3 18-26. (A) Propionylé non modifié, (B) peptide K23Ac propionylé dans les deux autres positions, et (C) K18Ac propionylé dans les deux autres positions. Remarquez les avantages de la séparation de mobilité pour le cas des isomères structuraux illustrés dans les panneaux B et C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Exemple de séquençage peptidique de fragmentation MS/MS à l’aide de PASEF. Des spectres de fragments ont été obtenus à partir d’un logiciel d’analyse protéomique pour le peptide H3 avec des positions d’acides aminés 18-26. (A) propionylé non modifié, (B) peptide K23Ac propionylé dans les deux autres positions, et (C) K18Ac propionylé dans les deux autres positions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Exemple d’un résumé visuel de l’analyse PTM des histones. Résultats des peptides et PTM observés à partir (A) d’un étalon H3 et (B) H3 à partir de cellules HeLa S3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Caractéristiques de la SM/MS LC-TIMS-ToF du peptide standard et HeLa S3. Liste des peptides cibles et observés, y compris les propriétés expérimentales (c.-à-d. temps de rétention, m/z, 1/Ko et zones de pics LC). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les histones sont des protéines de base qui régulent la structure de la chromatine en interagissant avec l’ADN sous forme d’octamères constitués des quatre histones centrales (deux de chacune des H2A, H2B, H3 et H4)20. Les histones contiennent de nombreux résidus de lysine et d’arginine, qui sont facilement modifiés, ce qui conduit à des PTM étendus qui modifient la chimie de la chromatine en influençant la fonction des histones ou en se liant à d’autres protéines cellulaires21. Les PTM peuvent susciter des réponses biologiques en travaillant en tandem, des groupes spécifiques de PTM ayant été rapportés dans plusieurs maladies, notamment plusieurs types de cancer22.

Lorsque les dommages à l’ADN sont reconnus au niveau cellulaire, ils sont instantanément suivis par l’action d’une cascade de signalisation complexe où les lésions sont marquées, suivie de la coordination de la progression du cycle cellulaire et de l’activation des voies de réparation requises. De plus, les dommages à l’ADN induisent diverses modifications, telles que les adduits acétyle et méthyle, qui facilitent le recrutement des protéines23. La grande variété de PTM impliqués dans les lésions de l’ADN conduit à la question de savoir comment ces mécanismes moléculaires régulent leur coexistence et quelle est l’importance fonctionnelle de la défense de l’intégrité du génome à travers un réseau intégré extrêmement complexe. Par exemple, la triméthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) a été liée à différentes pathologies dans diverses maladies24. Pour de telles raisons, il est nécessaire de développer des méthodologies analytiques instrumentales qui permettent la caractérisation complète de ces modifications au niveau cellulaire23.

L’analyse des extractions d’histones HeLa S3 à l’aide d’un logiciel d’analyse manuelle des données et d’un logiciel d’analyse protéomique a révélé des PTM, y compris l’acétylation (+42,01 Da), la méthyl-propionylation (+70,04 Da), la diméthylation (+28,03 Da) et la triméthylation (+42,05) pour plusieurs protéines d’histones. De plus, la méthode MS/MS basée sur PASEF a permis de différencier certains peptides isomères positionnels portant les mêmes PTM.

Dans l’introduction, les avantages du couplage LC-TIMS-ToF MS/MS dans l’étude des PTM pour montrer les développements récents de la DDA en utilisant une accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par collision sont brièvement décrits. L’idée principale est d’établir une méthodologie qui permette de résoudre les signaux provenant de différents peptides et que, jusqu’à présent, les techniques classiques n’ont pas été en mesure de résoudre. Le processus de dérivatisation à l’aide d’anhydride propionique empêche le clivage des C-terminaux de la lysine par la trypsine, générant des peptides plus longs et plus informatifs. Des peptides ayant le même m/z et le même temps de rétention ont pu être identifiés par leurs modèles de fragmentation, mais il a également été constaté que certaines de ces espèces pouvaient être séparées dans le domaine de la mobilité en utilisant cette méthode LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS.

Pour mieux comprendre cela, la figure 8 représente trois caractéristiques principales de toute molécule, permettant ainsi l’identification d’un composé, qu’il s’agisse de protéines intactes, de lipides ou de peptides (en l’occurrence, l’histone H3 18-26), pour ne citer que quelques exemples. Ces caractéristiques comprennent le temps de rétention (min) d’un composé dans la colonne chromatographique, le rapport masse-charge (m/z) de chaque composé et la mobilité (1/Ko) que présentent ces composés lorsqu’ils interagissent avec le gaz de dérive. Dans la figure 8A, le peptide H3 non modifié 18-26 a un RT de 28,15 min et présente deux bandes dans son spectre de mobilité, indiquant qu’il a au moins deux conformations, un résultat qui est soupçonné d’être le résultat des deux lysines (18 et 23) qui ont été propionylées selon le protocole décrit précédemment. Les spectres suivants (Figure 8B,C) montrent le même peptide (H3 18-26) mais faisant varier la position du groupe acétylation (42.02) entre B, K18Ac et C, K23Ac. Ces deux isomères (K18Ac et K23Ac) ont été identifiés par le mobilogramme, car ils présentent des distributions spatiales différentes, ce qui entraîne des interactions différentes avec le gaz dans la cellule TIMS. L’importance de cette méthode réside dans la possibilité d’identifier et d’étudier plus en détail les différents PTM qui ont été associés à différentes maladies à travers, par exemple, des dommages à l’ADN.

Lorsque les données de fragmentation sont rares, il est difficile d’identifier une modification au niveau d’un résidu spécifique car deux ou plusieurs modifications dissemblables peuvent se produire simultanément au niveau (ou à proximité) des mêmes résidus et peuvent être comprises comme une seule modification25. Cela pourrait être résolu en s’assurant que le peptide non modifié a été identifié, en particulier en utilisant un étalon pour confirmer ou infirmer la présence d’une seule modification plutôt que de plusieurs modifications (tableau 1).

Pour éviter une contamination excessive ou des extractions d’histones impures, il est important de vérifier la qualité des réactifs avant utilisation. Par exemple, si la solution tampon NIB est stockée et utilisée en vrac, assurez-vous que la solution est claire et qu’elle n’a pas d’apparence extérieure de turbidité ou de présentation anormale. La turbidité peut être le résultat de la croissance bactérienne, qui contaminerait les échantillons et pourrait entraîner un mélange d’histones et de protéines bactériennes. De plus, il est recommandé de préparer de nouvelles courbes d’étalonnage pour les essais, tels que le test BCA ou Bradford utilisé pour déterminer la concentration en protéines, en veillant à ce que la protéine utilisée pour la courbe d’étalonnage ne soit pas périmée ou dégradée.

Cette méthode peut être étendue à d’autres types de cellules ou d’organismes, par exemple les moustiques. Dans le cas d’organismes entiers ou partiels, il est particulièrement important de sélectionner un nombre approprié d’organismes pour s’assurer que la concentration finale d’histones convient à l’analyse.

De plus, à titre de directive générale pour l’entretien du spectromètre de masse, l’avant doit être nettoyé périodiquement pour éviter l’accumulation sur l’instrument et la contamination entre les cycles. Ce nettoyage doit inclure le rideau, la plaque à orifice et le quadripôle, selon les besoins.

En général, lorsqu’un LC est utilisé, il est nécessaire de prendre en considération la préparation de la ou des phases mobiles fraîches chaque semaine à l’aide de solvants de qualité MS. Il est recommandé de conserver des pipettes et de la verrerie dédiées à la préparation de la phase mobile et de purger les lignes LC chaque fois que de nouvelles solutions sont placées sur le système. Les colonnes de protection et de séparation doivent généralement être remplacées toutes les 100 à 200 injections et 500 à 1500 injections, respectivement26. Assurez-vous d’injecter des blancs avant et après l’analyse d’un lot d’échantillons. S’il y a un grand nombre d’échantillons dans un lot donné, on peut également envisager d’analyser un blanc à différents intervalles dans le lot.

Le protocole fournit un flux de travail DDA basé sur PASEF pour détecter les PTM d’histones et différencier les espèces isobariques et isomères en fonction de la mobilité ionique.

Ce protocole nécessite une préparation approfondie des échantillons, et le temps total de préparation des échantillons expérimentaux doit être pris en compte. En moyenne, le protocole de préparation des échantillons nécessite 2 à 3 jours ouvrables. De plus, les différences entre les laboratoires et les versions des instruments peuvent affecter la sensibilité globale de l’analyse.

Très peu de logiciels d’analyse de données protéomiques ont été jugés adéquats pour une utilisation dans l’analyse des histones par des méthodes ascendantes sans ajustement ou correction manuelle 27,28,29. Les résultats doivent (au moins dans un premier temps) être confirmés à l’aide d’une analyse manuelle, ce qui prend également du temps. Si un logiciel analytique est utilisé, il doit avoir des capacités d’annotation MS/MS, qui sont généralement faciles à confirmer ou à rejeter.

Il convient également de mentionner qu’il est impossible de séparer les isomères par spectrométrie de masse à moins qu’une cellule TIMS ne soit insérée et que des valeurs de mobilité ne soient utilisées ; par exemple, les positions des modifications des histones peuvent être déterminées à l’aide de modèles de fragmentation (PASEF).

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Disclosures

Melvin A. Park et Matthew Willetts sont des employés de Bruker Daltonics Inc., le fabricant de l’instrument timsTOF.

Acknowledgments

Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation dans le cadre de la subvention No. HRD-1547798 et Grant No. HRD-2111661. Ces subventions NSF ont été accordées à la Florida International University dans le cadre du programme Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Il s’agit de la contribution numéro 1672 de l’Institut de l’environnement, un programme prééminent de l’Université internationale de Floride. Un soutien supplémentaire a été fourni par l’Institut national de la santé dans le cadre de la subvention n°. R21AI135469 à Francisco Fernandez-Lima et Grant No. R01HD106051 à Benjamin A. Garcia, ainsi que par la National Science Foundation sous la subvention No. CHE-2127882 à Benjamin A. Garcia. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Mario Gomez Hernandez pour son soutien initial lors du développement initial de la méthode.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060710 Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-282-300 Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060100 Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40 Thermo Fisher Scientific 28324 NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ (Mediatech) MT21031CM
15 mL Conical Tubes Corning 352196 Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 02-707-138 Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060310 Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737 Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes Corning 352070 Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate Thermo Fisher Scientific 12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL Axygen P-DW-500-C-S
Acetone Sigma Aldrich 179124 ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN) Thermo Fisher Scientific A998 HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS120 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF Thermo Fisher Scientific 328110500 AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 Sigma Aldrich 09830 BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH Sigma Aldrich AX1303 Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar) Airgas AR HP 300
BEH C18 HPLC column Waters 186003625 XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2 Sigma Aldrich C4901 Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer Thermo Fisher Scientific 13151014
Ceramic scoring wafer Restek 20116
Compass DataAnalysis 6.0 Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2 Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1 Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 89237526
Disposable Cell Lifters Thermo Fisher Scientific  08100240 Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-363 Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific P2325 1 M
Formic acid (FA) Sigma Aldrich 695076 ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD (Molex (Polymicro) TSP075375
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38S Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes Sigma Aldrich BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph  Shimadzu Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl Sigma Aldrich 258148 ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å Thermo Fisher Scientific 60106-402
Hypersep cartridge Thermo Fisher Scientific 60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF Agilent G1969-85000 TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC Thermo Fisher Scientific A454 Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube Adapters GL Sciences 501021514
Microcystin Thermo Fisher Scientific 50-200-8727 Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm LEAP PAL Parts LAP.11190933
Nanodrop Thermo Fisher Scientific model: ND3300
Nitrogen (N2) Airgas NI UHP300
PEAKS Studio X+ Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek Micro Essential Lab JR-113 Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl Sigma Aldrich P3911 ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell Next Advance  model: PC77
Propionic Anhydride Sigma Aldrich 8.00608 For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) NuAire, model: Nuwind NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g ESI Source Solutions r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels Bio-Rad 4569035 Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate Thermo Fisher Scientific A11079.06 98+%
Sodium chloride, NaCl Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18 VWR 76333-134 Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor Savant model: SC210A
Sucrose Millipore 1.07651 suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4  Sigma Aldrich 339741 99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer Bruker Daltonics model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA Sigma Aldrich T0699 6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich 302031 Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate Advion model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057
Tube rotator Thermo Fisher Scientific 88881001
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS118 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

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Chimie numéro 203
Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol
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Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N.,… More

Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N., Valadares Tose, L., Willetts, M., Park, M. A., Bhanu, N. V., Garcia, B. A., Fernandez-Lima, F. Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (203), e65589, doi:10.3791/65589 (2024).

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