De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Hier wird eine Methode zum Screening von Lipidstrukturen durch Markierung stabiler Isotope unter Verwendung ihrer Retentionszeit, Mobilität und Fragmentierung vorgestellt.
Abstract
Lipide sind sehr vielfältig, und kleine Veränderungen in der Lipidstruktur und -zusammensetzung können tiefgreifende Auswirkungen auf kritische biologische Funktionen haben. Die Markierung stabiler Isotope (SIL) bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Lipidverteilung, -mobilisierung und des Metabolismus sowie für die De-novo-Lipidsynthese . Die erfolgreiche Implementierung der SIL-Technik erfordert die Entfernung von Interferenzen durch endogene Moleküle. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein analytisches Hochdurchsatzprotokoll für das Screening von SIL-Lipiden aus biologischen Proben; Es werden Beispiele für die De-novo-Identifizierung von Lipiden während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken gezeigt. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen und Massenspektrometrie ermöglicht die Trennung und Zuordnung von Lipiden aus einer einzelnen Probe in einem einzigen Scan (<1 h). Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der datenabhängigen Erfassung und der datenunabhängigen Erfassung, indem er parallele Akkumulation in der Mobilitätsfalle verwendet, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Die Messung von SIL auf der Ebene der Fettsäurekette zeigt Veränderungen in der Lipiddynamik während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken. Die De-novo-Strukturen der Lipide werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugeordnet.
Introduction
Bei der Analyse von Lipiddaten ist die Markierung stabiler Isotope (SIL) eine effektive Methode, um Stoffwechselwege in lebenden Organismen zu beurteilen. Bei dieser Methode werden Atome innerhalb eines Analyten durch stabile Isotope ersetzt, die 13C oder 2H enthalten. Diese Isotope werden weiter in Vorläufer eingebaut, die später in die Fettsäuren eingebettet werden und die Bereiche markieren, in denen sie sich befinden. Mit diesen Isotopen ist man in der Lage, die Verteilung und den Stoffwechsel von Lipiden zu identifizieren, da sie sich vom unmarkierten Hintergrundabheben 1. Gängige Massenspektrometrie-Plattformen sind nicht in der Lage, das Signal, das von endogenen Molekülen ausgeht,zu unterscheiden 2. Der Erfolg von SIL erfordert den Einsatz ultrahochauflösender Analysewerkzeuge. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit der hochauflösenden Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen, der sequentiellen Fragmentierung, der Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ermöglicht die Trennung von markierten und unmarkierten Spezies2. Der Vorteil der LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-Analyse besteht darin, dass das MS-Signal nach der Retentionszeit (RT) und Mobilität gefiltert werden kann, wodurch potenzielle Interferenzen endogener Moleküle sowie die Quantifizierung und Trennung aller gewünschten Spezies reduziert werden2. Bei TIMS wird ein Ion zunächst gegen eine gasmobile Phase stationär gehalten und anschließend entsprechend ihrer Beweglichkeit wieder freigesetzt. Dies bietet hochauflösende Mobilogramme und arbeitet gleichzeitig mit einer niedrigeren Spannung als frühere IMS-Instrumente3. Mobilogramme sind Diagramme der Masse zu Ladung im Vergleich zur Driftzeit, die zur Unterscheidung zwischen Verbindungen auf der Grundlage ihrer Driftzeit und des Ausmaßes der Überlappungverwendet werden können 4.
Durch die Verwendung einer zusätzlichen PASEF-Technik wird die Sequenzierungsgeschwindigkeit erheblich erhöht, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen5. Die PASEF-Theorie beinhaltet die Akkumulation von Ionen, gefolgt von ihrer sequentiellen Freisetzung in der Reihenfolge ihrer Mobilität. Dies geschieht durch die Akkumulation von Ionen in paralleler Ausrichtung zu ihrer Beweglichkeit. Die Akkumulation auf diese Weise verhindert den Ionenverlust. Darüber hinaus erfolgt die Auswahl der Vorläuferionen gleichzeitig mit der Akkumulation und Freisetzung der Ionen. Bei dieser Methode wählt PASEF bei jedem TIMS-Scan mehrere Vorläufer in Reihe aus, anstatt der einzelnen Vorläufer pro Scan, die für ein TIMS-Gerät typisch sind, das PASEF nicht verwendet. Wenn die Vorläuferionen gleichzeitig akkumuliert und in 2-ms-Spitzen innerhalb eines TIMS-Scans von etwa 100 ms pro Frame freigesetzt werden, wird das Signal um mehr als eine Größenordnung verstärkt, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis3 erhöht wird. Die PASEF-Ergänzung des TIMS erhöht die Effizienz des MS/MS. Da TIMS-PASEF mit MS/MS gekoppelt ist, ist eine effizientere Fragmentierung möglich. Im Gegensatz zur herkömmlichen MS/MS-Detektion wird das Vorläufersignal vom TIMS-PASEF komprimiert, und die Fragmentionen werden gleichzeitig mit der TIMS-Elutionszeit und der Ionenmobilitätsposition des Vorläufers3 detektiert.
Bei der Datenerfassung von einem Massenspektrometer gibt es Optionen im gewünschten Scan-Modus. Bei der datenabhängigen Erfassung (DDA) werden Vorläuferionen aus dem MS1-Scan basierend auf ihren Häufigkeiten ausgewählt, bevor sie fragmentiert und der MS2-Scan durchgeführt wird. In diesem Scan-Modus werden so viele Vorläufer wie möglich fragmentiert. Der DDA-Ansatz ist zielgerichtet, und die Ergebnisse hängen von der Ionenauswahlab 3. Allerdings hat DDA-PASEF oft Probleme bei der Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten. Während DDA ein großartiges Werkzeug für eine fokussierte Analyse ist, haben komplexe Mischungen größere Schwierigkeiten bei der Datenerfassung6. Dies liegt daran, dass nur eine kleine Menge an Ionen gleichzeitig überwacht werden kann3. Die datenunabhängige Erfassung (DIA) ist eine Methode, bei der vorausgewählte Fenster von m/z unabhängig von ihrer Intensität fragmentiert werden und alle innerhalb des Bereichs7 gescannt werden. Mit diesem Scan-Modus werden ganze Ionenwolken vom IMS zum Massenspektrometer3 übertragen. In Proteomik-Studien führt dies dazu, dass im Vergleich zu DDA größere Mengen an Proteinen in kürzerer Zeit quantifiziert werden können. Darüber hinaus fehlen bei DIA im Vergleich zu DDA weniger m/z-Werte. Daher hat diese Alternative große Verbesserungen bei der Reproduzierbarkeit der Daten im Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Quantifizierung als DDA gezeigt. In der vorliegenden Arbeit ist es unser Ziel, DIA in die von Tose et al.2 beschriebene Methode zu implementieren. Wir verbesserten die Reproduzierbarkeit und Intensität der Signale und lieferten weitere und schlüssigere Informationen über die Mobilisierung, Verteilung und den Metabolismus von SIL-Lipiden in biologischen Proben, indem wir die Vorteile der DDA- und DIA-Akquisition nutzten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der Bewertung der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Parameter DIA-PASEF und MS/MS auf die betreffenden Triglyceride anwendbar sind. Insbesondere sollten die Mobilitätsfenster und die Fensterbreite dem Muster der Triglyceride folgen. Dies kann mit einem vorherigen Lauf mit der DDA-Methode ermittelt werden. Bei der Verfolgung der Triglyceride im internen Standard sollten die Fenster für die DIA-Einrichtung alle vorab identifizierten Moleküle von Interesse abdecken. Die Fenster sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Beiträge von Dr. Cesar Ramirez bei der Entwicklung der ersten Methoden. Diese Forschung wurde durch die NIAID-Zuschüsse finanziert, die an FGN, Projekt 22-21244S, R21AI167849 der Czech Science Foundation, Tschechische Republik, an MN vergeben wurden.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
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