安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡
Summary
ここでは、安定同位体標識により、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションを利用した脂質構造をスクリーニングする方法を紹介します。
Abstract
脂質は非常に多様であり、脂質の構造と組成のわずかな変化は、重要な生物学的機能に大きな影響を与える可能性があります。安定同位体標識(SIL)は、脂質の分布、動員、代謝、 およびde novo 脂質合成の研究にいくつかの利点を提供します。SIL技術を成功裏に実装するには、内因性分子からの干渉の除去が必要です。本研究では、生体サンプルからSIL脂質をスクリーニングするためのハイスループット分析プロトコルについて説明します。蚊の卵巣発育中の脂質 de novo 同定の例を示します。補完的な液体クロマトグラフィー、トラップドイオンモビリティー分析、および質量分析を使用すると、1回のスキャン(<1時間)で1つのサンプルから分離および脂質の割り当てが可能になります。ここで説明するアプローチは、データ依存型取得とデータ非依存型取得の最近の開発を利用しており、移動度トラップでの並列蓄積とそれに続く逐次フラグメンテーションと衝突による解離を使用します。脂肪酸鎖レベルでのSILの測定により、蚊の卵巣発育中の脂質動態の変化が明らかになります。脂質 de novo 構造は、その保持時間、移動度、およびフラグメンテーションパターンに基づいて自信を持って割り当てられます。
Introduction
脂質データを分析する場合、安定同位体標識(SIL)は、生体内の代謝経路を評価するための効果的な方法です。この方法では、分析種内の原子を 13Cまたは 2Hを含む安定同位体で置換します。これらの同位体はさらに前駆体に組み込まれ、後で脂肪酸に埋め込まれ、それらが存在する領域にラベルが付けられます。これらの同位体を使用すると、脂質の分布と代謝を特定することができます。脂質は、ラベルのない背景1と対照的です。一般的な質量分析プラットフォームでは、内因性分子からのシグナルを区別することができません2。SILを成功させるには、超高分解能分析ツールの使用が必要です。高分解能のトラップイオンモビリティー分光法-並列蓄積シーケンシャルフラグメンテーション飛行時間型タンデム質量分析(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーにより、標識分子種と非標識分子種の分離が可能になります2。LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 分析の利点は、MS シグナルを保持時間(RT)と移動度でフィルタリングできるため、内因性分子の潜在的な干渉を減らすことができるだけでなく、必要なすべての分子種の定量と分離できることです2。TIMSでは、イオンは最初にガス移動相に対して静止したままになり、その後、その移動度に応じて放出されます。これにより、以前のIMS計装3よりも低い電圧で動作しながら、高解像度のモビログラムが得られます。モビログラムは、電荷する質量とドリフト時間のプロットであり、ドリフト時間とオーバーラップの量に基づいて化合物を区別するために使用できます4。
追加のPASEF技術を使用することで、感度5を犠牲にすることなく、シーケンシング速度が大幅に向上します。PASEF理論では、イオンが蓄積し、その後、移動度の順に順次放出されます。これは、イオンをその移動度に平行に整列させて蓄積することによって行われます。このように蓄積することで、イオンロスを防ぎます。さらに、プリカーサーイオンの選択は、イオンの蓄積と放出と同時に行われます。この方法では、PASEFは、PASEFを使用しないTIMS装置に典型的なスキャンごとの個々の前駆体ではなく、各TIMSスキャン中に複数の前駆体を直列に選択します。フレームあたり約100 msのTIMSスキャンで、プリカーサーイオンが2 msのピークで同時に蓄積および放出されると、シグナルは1桁以上増幅されるため、S/N比が増加します3。TIMSにPASEFを追加すると、MS/MSの効率が向上します。TIMS-PASEFはMS/MSと結合されているため、より効率的なフラグメンテーションが可能です。従来のMS/MS検出とは異なり、TIMS-PASEFからプリカーサーシグナルを圧縮し、プリカーサー3のTIMS溶出時間およびイオン移動度位置にフラグメントイオンを同時に検出します。
質量分析計からデータを取得する場合、必要なスキャンモードのオプションがあります。データ依存性取得(DDA)は、MS1スキャンから存在量に基づいてプリカーサーイオンを選択し、その後、プリカーサーイオンを断片化してMS2スキャンを実行します。このスキャンモードは、できるだけ多くの前駆体をフラグメント化します。DDAアプローチはターゲットを絞っており、結果はイオン選択によって異なります3。しかし、DDA-PASEFは、反復間の再現性に問題が生じることがよくあります。DDAは焦点を絞った分析に最適なツールですが、複雑な混合物はデータ取得がより困難になります6。これは、同時に監視できるイオンが少量しかないためです3。データ独立集録(DIA)は、事前に選択されたm/zのウィンドウを強度とは無関係に断片化し、すべてを範囲7内でスキャンする方法です。このスキャンモードでは、イオン雲全体がIMSから質量分析計3に送信されます。プロテオミクス研究では、DDAと比較して、より短い時間でより多くのタンパク質を定量することができます。さらに、DIAはDDAと比較してm/z値の欠落が少なくなっています。したがって、この代替案は、DDAよりもS/N比のデータの再現性が大幅に向上し、定量化が優れていることを示しています。この本研究では、Tose et al.2によって報告された方法にDIAを実装することを目標としています。シグナルの再現性と強度を向上させ、DDAおよびDIA取得を活用して、生体サンプル中のSIL脂質の動員、分布、代謝に関する決定的な情報をますます得ることができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの使用を評価する際には、DIA-PASEFおよびMS/MSパラメータが問題のトリグリセリドに適用可能であることを確認することが不可欠です。具体的には、モビリティウィンドウとウィンドウ幅はトリグリセリドのパターンに従う必要があります。これは、DDA メソッドを使用して前回の実行で決定できます。内部標準でトリグリセリドを追跡する場合、DIAセットアップのウィンドウは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、初期のメソッド開発における Cesar Ramirez 博士の貢献に感謝したいと思います。この研究は、NIAIDの助成金R21AI167849 FGNのプロジェクト22-21244S、チェコ科学財団、チェコ共和国からミネソタ州に資金提供されました。
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
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