تتبع الدهون الجديدة باستخدام وسم النظائر المستقرة LC-TIMS-TOF MS / MS
Summary
تظهر هنا طريقة لفحص التراكيب الليبيدة من خلال وضع العلامات على النظائر المستقرة باستخدام وقت الاحتفاظ بها وحركتها وتجزئتها.
Abstract
الليبيدات شديدة التنوع ، ويمكن أن يكون للتغيرات الصغيرة في هياكل الدهون وتكوينها تأثيرات عميقة على الوظائف البيولوجية الحرجة. يوفر وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) العديد من المزايا لدراسة توزيع الدهون وتعبئتها واستقلابها ، بالإضافة إلى تخليق الدهون من جديد . يتطلب التنفيذ الناجح لتقنية SIL إزالة التداخلات من الجزيئات الداخلية. في العمل الحالي ، نصف بروتوكولا تحليليا عالي الإنتاجية لفحص دهون SIL من العينات البيولوجية. سيتم عرض أمثلة على تحديد الدهون دي نوفو أثناء تطور مبيض البعوض. يسمح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية لقياس مطياف الحركة الأيونية المحاصرة وقياس الطيف الكتلي بالفصل وتخصيص الدهون من عينة واحدة في مسح واحد (<1 ساعة). يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الاستحواذ المعتمد على البيانات والاكتساب المستقل للبيانات ، باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل متبوعا بالتجزؤ المتسلسل والتفكك الناجم عن الاصطدام. يكشف قياس SIL على مستوى سلسلة الأحماض الدهنية عن تغيرات في ديناميكيات الدهون أثناء تطور المبيض للبعوض. يتم تعيين هياكل الدهون الجديدة بثقة بناء على وقت الاحتفاظ بها وحركتها ونمط تجزئتها.
Introduction
عند تحليل بيانات الدهون ، يعد وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) طريقة فعالة لتقييم المسارات الأيضية في الكائنات الحية. في هذه الطريقة، تستبدل الذرات الموجودة داخل المادة المراد تحليلها بنظائر مستقرة تحتوي على 13C أو 2H. يتم دمج هذه النظائر بشكل أكبر في السلائف ، والتي يتم تضمينها لاحقا داخل الأحماض الدهنية ، مع تسمية المناطق التي توجد فيها. باستخدام هذه النظائر ، يمكن للمرء تحديد توزيع الدهون واستقلابها ، لأنها ستتناقض مع الخلفية غير المسماة1. منصات قياس الطيف الكتلي الشائعة غير قادرة على تمييز الإشارة القادمة من الجزيئات الداخلية2. يتطلب نجاح SIL استخدام أدوات تحليلية فائقة الدقة. يسمح الكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطياف الحركة الأيونية المحاصرة عالية الدقة والتراكم المتوازي والتجزئة المتسلسلة ووقت الطيران (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) بفصل الأنواع الموسومة وغير الموسومة2. تتمثل ميزة تحليل LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS في أنه يمكن ترشيح إشارة MS من خلال وقت الاحتفاظ (RT) والتنقل ، وبالتالي تقليل التداخلات المحتملة للجزيئات الداخلية ، وكذلك القياس الكمي وفصل جميع الأنواعالمرغوبة 2. في TIMS ، يتم تثبيت الأيون أولا مقابل طور متنقل للغاز ثم يتم إطلاقه لاحقا وفقا لحركته. يوفر هذا مخططات نقل عالية الدقة أثناء التشغيل بجهد أقل من أجهزة IMSالسابقة 3. Mobilograms عبارة عن مخططات كتلية للشحن مقابل وقت الانجراف يمكن استخدامها للتمييز بين المركبات بناء على وقت الانجراف ومقدار التداخل4.
باستخدام تقنية PASEF إضافية ، تزداد سرعة التسلسل بشكل كبير دون التضحية بالحساسية5. تتضمن نظرية PASEF تراكم الأيونات متبوعة بإطلاقها المتسلسل بترتيب حركتها. يتم ذلك عن طريق تراكم الأيونات في محاذاة متوازية لحركتها. التراكم بهذه الطريقة يمنع فقدان الأيونات. علاوة على ذلك ، يحدث اختيار أيون السلائف في وقت واحد مع تراكم الأيونات وإطلاقها. وبهذه الطريقة، تختار PASEF سلائف متعددة على التوالي خلال كل مسح TIMS، بدلا من السلائف الفردية لكل مسح نموذجي لأداة TIMS التي لا تستخدم PASEF. عندما تتراكم أيونات السلائف بشكل متزامن وتطلق في قمم 2 مللي ثانية ضمن مسح TIMS يبلغ حوالي 100 مللي ثانية لكل إطار ، يتم تضخيم الإشارة بأكثر من ترتيب واحد من حيث الحجم ، وبالتالي زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء3. وتؤدي إضافة نظام PASEF إلى نظام TIMS إلى زيادة كفاءة نظام إدارة السلامة/الإدارة. وبما أن نظام TIMS-PASEF مقترن بنظام MS/MS ، فمن الممكن إجراء تجزئة أكثر كفاءة. وخلافا للكشف التقليدي عن MS/MS، تضغط إشارة السلائف من TIMS-PASEF، وتكتشف أيونات الشظايا في وقت واحد مع وقت الشطف TIMS وموضع الحركة الأيونية للسلائف3.
عند الحصول على البيانات من مطياف الكتلة ، هناك خيارات في وضع المسح المطلوب. يحدد الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) أيونات السلائف من فحص MS1 بناء على وفرتها ، قبل تجزئتها وإجراء فحص MS2. يعمل وضع المسح هذا على تجزئة أكبر عدد ممكن من السلائف. نهج DDA مستهدف ، وستعتمد النتائج على اختيار الأيونات3. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه DDA-PASEF مشاكل في قابلية التكرار بين النسخ المتماثلة. في حين أن DDA هي أداة رائعة في التحليل المركز ، فإن المخاليط المعقدة تواجه صعوبة أكبر في الحصول على بياناتها6. وذلك لأنه يمكن مراقبة كمية صغيرة فقط من الأيونات في وقت واحد3. الحصول على البيانات المستقلة (DIA) هو طريقة يتم فيها تجزئة النوافذ المحددة مسبقا من m / z بشكل مستقل عن شدتها ، ويتم مسحها جميعا ضمن النطاق7. باستخدام وضع المسح هذا ، تنتقل السحب الأيونية بأكملها من IMS إلى مطياف الكتلة3. في دراسات البروتينات ، ينتج عن هذا كميات أكبر من البروتينات التي يتم قياسها كميا في فترة زمنية أقصر مقارنة ب DDA. بالإضافة إلى ذلك ، يفتقد DIA عددا أقل من قيم m / z مقارنة ب DDA. لذلك ، أظهر هذا البديل تحسينات كبيرة في استنساخ البيانات في نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقياس الكمي بشكل أفضل من DDA. في هذا العمل الحالي ، هدفنا هو تنفيذ DIA بالطريقة التي أبلغ عنها Tose et al.2. قمنا بتحسين قابلية استنساخ الإشارات وشدتها ، مما أسفر عن معلومات أكثر وأكثر حسما حول تعبئة دهون SIL وتوزيعها واستقلابها في العينات البيولوجية مستفيدين من اكتساب DDA و DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند تقييم استخدام هذا البروتوكول ، من الضروري التأكد من أن معلمات DIA-PASEF و MS / MS قابلة للتطبيق على الدهون الثلاثية المعنية. على وجه التحديد ، يجب أن تتبع نوافذ التنقل وعرض النافذة نمط الدهون الثلاثية. يمكن تحديد ذلك من خلال تشغيل سابق باستخدام طريقة DDA. عند تتبع الدهون الثلاثية في المعيار الد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يحب المؤلفون الاعتراف بمساهمات الدكتور سيزار راميريز خلال تطورات الطريقة الأولية. تم تمويل هذا البحث من خلال منح NIAID R21AI167849 إلى FGN ، المشروع 22-21244S من مؤسسة العلوم التشيكية ، جمهورية التشيك إلى MN.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).
