De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Hier wordt een methode gepresenteerd voor het screenen van lipidestructuren door middel van stabiele isotopenlabeling door gebruik te maken van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatie.
Abstract
Lipiden zijn zeer divers en kleine veranderingen in lipidestructuren en -samenstelling kunnen ingrijpende effecten hebben op kritieke biologische functies. Stabiele isotopenetikettering (SIL) biedt verschillende voordelen voor de studie van lipidedistributie, mobilisatie en metabolisme, evenals de novo lipidensynthese. De succesvolle implementatie van de SIL-techniek vereist het verwijderen van interferenties van endogene moleculen. In dit werk beschrijven we een high-throughput analytisch protocol voor de screening van SIL-lipiden uit biologische monsters; Er zullen voorbeelden worden getoond van lipide de novo identificatie tijdens de ontwikkeling van de eierstokken van muggen. Het gebruik van complementaire vloeistofchromatografie, spectrometrie van ingesloten ionenmobiliteit en massaspectrometrie maakt de scheiding en toewijzing van lipiden van een enkel monster in een enkele scan (<1 uur) mogelijk. De beschreven aanpak maakt gebruik van recente ontwikkelingen op het gebied van data-afhankelijke acquisitie en data-onafhankelijke acquisitie, waarbij gebruik wordt gemaakt van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en botsing-geïnduceerde dissociatie. De meting van SIL op het niveau van de vetzuurketen onthult veranderingen in de lipidendynamiek tijdens de eierstokontwikkeling van muggen. De lipiden de novo-structuren worden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatiepatroon.
Introduction
Bij het analyseren van lipidegegevens is stabiele isotopenetikettering (SIL) een effectieve methode om metabole routes in levende organismen te beoordelen. Bij deze methode worden atomen in een analyt vervangen door stabiele isotopen die 13C of 2H bevatten. Deze isotopen worden verder opgenomen in voorlopers, die later worden ingebed in de vetzuren en de gebieden waarin ze zich bevinden labelen. Met deze isotopen is men in staat om de distributie en het metabolisme van lipiden te identificeren, omdat ze contrasteren met de niet-gelabelde achtergrond1. Gewone massaspectrometrieplatforms zijn niet in staat om het signaal te onderscheiden dat afkomstig is van endogene moleculen2. Het succes van SIL vereist het gebruik van analytische tools met ultrahoge resolutie. Vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge-resolutie ingesloten ionenmobiliteit spectrometrie-parallelle accumulatie, sequentiële fragmentatie-time-of-flight, tandem massaspectrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) maakt de scheiding mogelijk van gelabelde en niet-gelabelde soorten2. Het voordeel van LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-analyse is dat het MS-signaal kan worden gefilterd op basis van de retentietijd (RT) en mobiliteit, waardoor mogelijke interferenties van endogene moleculen worden verminderd, evenals kwantificering en scheiding van alle gewenste species2. Bij TIMS wordt een ion eerst stationair gehouden tegen een gasmobiele fase en vervolgens vrijgegeven op basis van zijn mobiliteit. Dit zorgt voor mobilogrammen met een hoge resolutie terwijl ze op een lagere spanning werken dan eerdere IMS-instrumentatie3. Mobilogrammen zijn grafieken van massa tot lading versus drifttijd die kunnen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verbindingen op basis van hun drifttijd en de mate van overlap4.
Door gebruik te maken van een extra PASEF-techniek wordt de sequencingsnelheid sterk verhoogd zonder dat dit ten koste gaat van de gevoeligheid5. De PASEF-theorie gaat uit van de accumulatie van ionen, gevolgd door hun opeenvolgende afgifte in de volgorde van hun mobiliteit. Dit wordt gedaan door ionen te accumuleren in parallelle uitlijning met hun mobiliteit. De accumulatie op deze manier voorkomt ionenverlies. Bovendien vindt de selectie van de voorloperionen gelijktijdig plaats met de accumulatie en afgifte van de ionen. Met deze methode selecteert PASEF tijdens elke TIMS-scan meerdere voorlopers in serie, in plaats van de individuele voorlopers per scan die typisch zijn voor een TIMS-instrument dat geen PASEF gebruikt. Wanneer de voorloperionen gelijktijdig worden geaccumuleerd en vrijgegeven in pieken van 2 ms binnen een TIMS-scan van ongeveer 100 ms per frame, wordt het signaal met meer dan één orde van grootte versterkt, waardoor de signaal-ruisverhouding3 toeneemt. De PASEF-toevoeging aan het TIMS verhoogt de efficiëntie van de MS/MS. Omdat de TIMS-PASEF gekoppeld is aan MS/MS, is een efficiëntere fragmentatie mogelijk. In tegenstelling tot conventionele MS/MS-detectie, wordt het voorlopersignaal gecomprimeerd van de TIMS-PASEF en worden de fragmentionen tegelijkertijd gedetecteerd naar de TIMS-elutietijd en ionenmobiliteitspositie van de voorloper3.
Bij het verkrijgen van gegevens van een massaspectrometer zijn er opties in de gewenste scanmodus. Data-afhankelijke acquisitie (DDA) selecteert voorloperionen uit de MS1-scan op basis van hun overvloed, voordat ze worden gefragmenteerd en de MS2-scan wordt uitgevoerd. Deze scanmodus fragmenteert zoveel mogelijk voorlopers. De DDA-aanpak is doelgericht en de resultaten zullen afhangen van de ionenselectie3. DDA-PASEF heeft echter vaak problemen met de reproduceerbaarheid tussen replicaten. Hoewel DDA een geweldig hulpmiddel is in een gerichte analyse, hebben complexe mengsels meer moeite met het verzamelen van gegevens6. Dit komt omdat slechts een kleine hoeveelheid ionen tegelijkertijd kan worden gecontroleerd3. Gegevensonafhankelijke acquisitie (DIA) is een methode waarbij vooraf geselecteerde vensters van m/z onafhankelijk van hun intensiteit worden gefragmenteerd en allemaal worden gescand binnen het bereik7. Met deze scanmodus worden volledige ionenwolken verzonden van het IMS naar de massaspectrometer3. In proteomics-studies leidt dit ertoe dat grotere hoeveelheden eiwitten in een kortere tijdspanne worden gekwantificeerd in vergelijking met DDA. Daarnaast mist DIA minder m/z waarden in vergelijking met DDA. Daarom heeft dit alternatief grote verbeteringen laten zien in de reproduceerbaarheid van gegevens in signaal-ruisverhouding en een betere kwantificering dan DDA. In dit huidige werk is ons doel om DIA te implementeren volgens de methode gerapporteerd door Tose et al.2. We verbeterden de reproduceerbaarheid en intensiteit van signalen, wat meer en meer overtuigende informatie opleverde over de mobilisatie, distributie en het metabolisme van SIL-lipiden in biologische monsters door gebruik te maken van DDA- en DIA-acquisitie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het beoordelen van het gebruik van dit protocol is het essentieel om ervoor te zorgen dat de parameters DIA-PASEF en MS/MS van toepassing zijn op de triglyceriden in kwestie. In het bijzonder moeten mobiliteitsvensters en vensterbreedte het patroon van de triglyceriden volgen. Dit kan worden bepaald met een eerdere run met behulp van de DDA-methode. Bij het volgen van de triglyceriden in de interne standaard, moeten de vensters voor de DIA-opstelling alle vooraf geïdentificeerde moleculen van belang omvatten. De ven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de bijdragen van Dr. Cesar Ramirez erkennen tijdens de eerste ontwikkelingen van de methode. Dit onderzoek werd gefinancierd door de NIAID-subsidies R21AI167849 aan FGN, project 22-21244S van de Czech Science Foundation, Tsjechië aan MN.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).
