Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.
Abstract
Os lipídios são altamente diversos e pequenas mudanças nas estruturas e composição lipídicas podem ter efeitos profundos nas funções biológicas críticas. A marcação de isótopos estáveis (SIL) oferece várias vantagens para o estudo da distribuição, mobilização e metabolismo de lipídios, bem como para a síntese lipídica de novo . A implementação bem-sucedida da técnica SIL requer a remoção de interferências de moléculas endógenas. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de lipídios SIL de amostras biológicas; Serão mostrados exemplos de identificação de lipídios de novo durante o desenvolvimento do ovário do mosquito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa permite a separação e atribuição de lipídios de uma única amostra em uma única varredura (<1 h). A abordagem descrita aproveita os desenvolvimentos recentes na aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados, usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. A medição do SIL no nível da cadeia de ácidos graxos revela mudanças na dinâmica lipídica durante o desenvolvimento do ovário dos mosquitos. As estruturas lipídicas de novo são atribuídas com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.
Introduction
Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo 13C ou 2H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado1. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveniente de moléculas endógenas2. O sucesso do SIL requer o uso de ferramentas analíticas de ultra-alta resolução. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de mobilidade iônica aprisionada de alta resolução – espectrometria de massa sequencial de fragmentação sequencial de acumulação sequencial – tempo de voo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) permite a separação de espécies marcadas e não marcadas2. A vantagem da análise LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS é que o sinal MS pode ser filtrado pelo tempo de retenção (RT) e mobilidade, reduzindo assim potenciais interferências de moléculas endógenas, bem como quantificação e separação de todas as espécies desejadas2. No TIMS, um íon é primeiro mantido estacionário contra uma fase gás-móvel e posteriormente liberado de acordo com sua mobilidade. Isso fornece alta resolução Mobilogramas são gráficos de massa a carregar versus tempo de deriva que podem ser usados para distinguir entre compostos com base em seu tempo de deriva e quantidade de sobreposição4.
Usando uma técnica PASEF adicional, a velocidade de sequenciamento é bastante aumentada sem sacrificar a sensibilidade5. A teoria PASEF envolve o acúmulo de íons seguido por sua liberação sequencial na ordem de sua mobilidade. Isso é feito acumulando íons em alinhamento paralelo à sua mobilidade. O acúmulo dessa maneira evita a perda de íons. Além disso, a seleção do íon precursor ocorre simultaneamente com o acúmulo e a liberação dos íons. Com este método, o PASEF seleciona vários precursores em série durante cada varredura TIMS, em vez dos precursores individuais por varredura típicos de um instrumento TIMS que não usa PASEF. Quando os íons precursores são acumulados e liberados simultaneamente em picos de 2 ms em uma varredura TIMS de aproximadamente 100 ms por quadro, o sinal é amplificado em mais de uma ordem de magnitude, aumentando assim a relação sinal-ruído3. A adição do PASEF ao TIMS aumenta a eficiência do MS/MS. Como o TIMS-PASEF é acoplado ao MS/MS, é possível uma fragmentação mais eficiente. Ao contrário da detecção convencional de MS/MS, o sinal precursor é comprimido a partir do TIMS-PASEF e os íons fragmentos são detectados simultaneamente ao tempo de eluição do TIMS e à posição de mobilidade iônica do precursor3.
Ao adquirir dados de um espectrômetro de massa, existem opções no modo de varredura desejado. A aquisição dependente de dados (DDA) seleciona íons precursores da varredura MS1 com base em suas abundâncias, antes de fragmentá-los e realizar a varredura MS2. Este modo de varredura fragmenta o maior número possível de precursores. A abordagem DDA é direcionada e os resultados dependerão da seleção de íons3. No entanto, o DDA-PASEF frequentemente apresenta problemas na reprodutibilidade entre as repetições. Embora a DDA seja uma ótima ferramenta em uma análise focada, misturas complexas têm maior dificuldade em sua aquisição de dados6. Isso ocorre porque apenas uma pequena quantidade de íons pode ser monitorada simultaneamente3. A aquisição independente de dados (DIA) é um método em que as janelas pré-selecionadas de m/z são fragmentadas independentemente de sua intensidade e todas são verificadas dentro do intervalo7. Com este modo de varredura, nuvens de íons inteiras são transmitidas do IMS para o espectrômetro de massa3. Em estudos proteômicos, isso resulta em maiores quantidades de proteínas sendo quantificadas em um período de tempo mais curto em comparação com o DDA. Além disso, o DIA perde menos valores de m/z em comparação com o DDA. Portanto, esta alternativa mostrou grandes melhorias na reprodutibilidade dos dados na relação sinal-ruído e melhor quantificação do que o DDA. No presente trabalho, nosso objetivo é implementar a DIA ao método relatado por Tose et al.2. Melhoramos a reprodutibilidade e a intensidade dos sinais, produzindo informações adicionais e mais conclusivas sobre a mobilização, distribuição e metabolismo de lipídios SIL em amostras biológicas aproveitando a aquisição de DDA e DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao avaliar o uso deste protocolo, é essencial garantir que os parâmetros DIA-PASEF e MS/MS sejam aplicáveis aos triglicerídeos em questão. Especificamente, as janelas de mobilidade e a largura da janela devem seguir o padrão dos triglicerídeos. Isso pode ser determinado com uma execução anterior usando o método DDA. Ao rastrear os triglicerídeos no padrão interno, as janelas para a configuração do DIA devem cobrir todas as moléculas de interesse pré-identificadas. As janelas devem ser todas de tamanhos ig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostam de reconhecer as contribuições do Dr. Cesar Ramirez durante o desenvolvimento inicial do método. Esta pesquisa foi financiada pelas bolsas NIAID R21AI167849 para FGN, projeto 22-21244S da Czech Science Foundation, República Tcheca para MN.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
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