Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Aquí se presenta un método para el cribado de estructuras lipídicas mediante el marcaje de isótopos estables mediante el uso de su tiempo de retención, movilidad y fragmentación.
Abstract
Los lípidos son muy diversos, y pequeños cambios en las estructuras y composición de los lípidos pueden tener efectos profundos en las funciones biológicas críticas. El marcaje de isótopos estables (SIL) ofrece varias ventajas para el estudio de la distribución, movilización y metabolismo de los lípidos, así como para la síntesis de lípidos de novo . La implementación exitosa de la técnica SIL requiere la eliminación de las interferencias de las moléculas endógenas. En el presente trabajo, describimos un protocolo analítico de alto rendimiento para el cribado de lípidos SIL a partir de muestras biológicas; Se mostrarán ejemplos de identificación de lípidos de novo durante el desarrollo del ovario del mosquito. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas permite la separación y asignación de lípidos a partir de una sola muestra en un solo escaneo (<1 h). El enfoque descrito aprovecha los desarrollos recientes en la adquisición dependiente de datos y la adquisición independiente de datos, utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad seguida de fragmentación secuencial y disociación inducida por colisiones. La medición del SIL a nivel de la cadena de ácidos grasos revela cambios en la dinámica lipídica durante el desarrollo ovárico de los mosquitos. Las estructuras de novo de lípidos se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación.
Introduction
Al analizar datos de lípidos, el marcaje de isótopos estables (SIL) es un método eficaz para evaluar las vías metabólicas en los organismos vivos. En este método, los átomos dentro de un analito son reemplazados por isótopos estables que contienen 13C o 2H. Estos isótopos se incorporan a los precursores, que luego se incrustan dentro de los ácidos grasos, marcando las áreas en las que residen. Con estos isótopos, se puede identificar la distribución y el metabolismo de los lípidos, ya que contrastarán con el fondo no marcado1. Las plataformas comunes de espectrometría de masas no son capaces de distinguir la señal procedente de las moléculas endógenas2. El éxito de SIL requiere el uso de herramientas analíticas de ultra alta resolución. La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem de alta resolución, de alta resolución, de concentración paralela, de fragmentación secuencial, de tiempo de vuelo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) permite la separación de especies marcadas y no marcadas2. La ventaja del análisis LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS es que la señal de MS puede ser filtrada por el tiempo de retención (RT) y la movilidad, reduciendo así las posibles interferencias de las moléculas endógenas, así como la cuantificación y separación de todas las especies deseadas2. En TIMS, un ion se mantiene primero estacionario contra una fase móvil de gas y posteriormente se libera de acuerdo con su movilidad. Esto proporciona mobilogramas de alta resolución mientras funciona a un voltaje más bajo que la instrumentación IMS anterior3. Los mobilogramas son gráficos de masa a cargar frente a tiempo de deriva que se pueden utilizar para distinguir entre compuestos en función de su tiempo de deriva y la cantidad de superposición4.
Mediante el uso de una técnica PASEF adicional, la velocidad de secuenciación aumenta considerablemente sin sacrificar la sensibilidad5. La teoría PASEF implica la acumulación de iones seguida de su liberación secuencial en el orden de su movilidad. Esto se hace acumulando iones en alineación paralela a su movilidad. La acumulación de esta manera evita la pérdida de iones. Además, la selección de iones precursores se produce simultáneamente con la acumulación y liberación de los iones. Con este método, PASEF selecciona múltiples precursores en serie durante cada exploración TIMS, en lugar de los precursores individuales por exploración típicos de un instrumento TIMS que no utiliza PASEF. Cuando los iones precursores se acumulan simultáneamente y se liberan en picos de 2 ms dentro de un escaneo TIMS de aproximadamente 100 ms por trama, la señal se amplifica en más de un orden de magnitud, aumentando así la relación señal-ruido3. La adición de PASEF al TIMS aumenta la eficiencia del MS/MS. Dado que el TIMS-PASEF está acoplado con MS/MS, es posible una fragmentación más eficiente. A diferencia de la detección convencional de MS/MS, la señal precursora se comprime desde el TIMS-PASEF, y los iones fragmentados se detectan simultáneamente con el tiempo de elución de TIMS y la posición de movilidad iónica del precursor3.
Al adquirir datos de un espectrómetro de masas, hay opciones en el modo de escaneo deseado. La adquisición dependiente de datos (DDA) selecciona los iones precursores del escaneo MS1 en función de sus abundancias, antes de fragmentarlos y realizar el escaneo MS2. Este modo de escaneo fragmenta tantos precursores como sea posible. El enfoque DDA es específico y los resultados dependerán de la selección de iones3. Sin embargo, DDA-PASEF a menudo tiene problemas en la reproducibilidad entre réplicas. Si bien el DDA es una gran herramienta en un análisis enfocado, las mezclas complejas tienen mayor dificultad en su adquisición de datos6. Esto se debe a que solo se puede monitorear una pequeña cantidad de iones simultáneamente3. La adquisición independiente de datos (DIA) es un método en el que las ventanas preseleccionadas de m/z se fragmentan independientemente de su intensidad, y todas se escanean dentro del rango7. Con este modo de escaneo, se transmiten nubes iónicas completas desde el IMS al espectrómetro de masas3. En los estudios de proteómica, esto da como resultado que se cuantifiquen mayores cantidades de proteínas en un período de tiempo más corto en comparación con el DDA. Además, DIA omite menos valores m/z en comparación con DDA. Por lo tanto, esta alternativa ha mostrado grandes mejoras en la reproducibilidad de los datos en la relación señal/ruido y una mejor cuantificación que el DDA. En el presente trabajo, nuestro objetivo es implementar DIA al método reportado por Tose et al.2. Mejoramos la reproducibilidad y la intensidad de las señales, proporcionando información adicional y más concluyente sobre la movilización, distribución y metabolismo de los lípidos SIL en muestras biológicas aprovechando la adquisición de DDA y DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al evaluar el uso de este protocolo, es esencial asegurarse de que los parámetros DIA-PASEF y MS/MS son aplicables a los triglicéridos en cuestión. Específicamente, las ventanas de movilidad y el ancho de la ventana deben seguir el patrón de los triglicéridos. Esto se puede determinar con una ejecución anterior utilizando el método DDA. Al realizar un seguimiento de los triglicéridos en el patrón interno, las ventanas para la configuración de DIA deben cubrir todas las moléculas de interés previamente identi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A los autores les gusta reconocer las contribuciones del Dr. César Ramírez durante el desarrollo inicial del método. Esta investigación fue financiada por las subvenciones del NIAID R21AI167849 a FGN, proyecto 22-21244S de la Fundación Checa de Ciencias, República Checa a MN.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
References
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).
