Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Summary

Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall’intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Abstract

L’enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia intestinale grave e potenzialmente fatale che è stata difficile da studiare a causa della sua complessa patogenesi, che rimane incompletamente compresa. La fisiopatologia della NEC comprende l’interruzione delle giunzioni strette intestinali, l’aumento della permeabilità della barriera intestinale, la morte delle cellule epiteliali, la disbiosi microbica e l’infiammazione disregolata. Gli strumenti tradizionali per studiare la NEC includono modelli animali, linee cellulari e organoidi intestinali umani o murini. Mentre gli studi che utilizzano questi sistemi modello hanno migliorato la comprensione del campo della fisiopatologia della malattia, la loro capacità di ricapitolare la complessità della NEC umana è limitata. È stato ora sviluppato un modello in vitro migliorato di NEC che utilizza la tecnologia microfluidica, denominato NEC-on-a-chip. Il modello NEC-on-a-chip consiste in un dispositivo microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati da un neonato pretermine, co-coltivato con cellule endoteliali umane e il microbioma di un neonato con NEC grave. Questo modello è uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici sulla fisiopatologia della NEC e una nuova risorsa per i test di scoperta di farmaci per le malattie intestinali neonatali. In questo manoscritto, verrà fornita una descrizione dettagliata del modello NEC-on-a-chip.

Introduction

L’enterocolite necrotizzante (NEC) colpisce i neonati pretermine, con un’incidenza fino al 10% in quelli nati di peso < 1500 g¹. La fisiopatologia della NEC è complessa e comprende danni all’epitelio intestinale, interruzione delle giunzioni strette intestinali, aumento della permeabilità della barriera intestinale, disregolazione immunitaria e morte delle cellule epiteliali ^2,3. La nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nella patogenesi della NEC rimane incompleta e, nonostante decenni di ricerca, non esistono ancora terapie mirate efficaci.

Un ostacolo significativo all’avanzamento della ricerca NEC è la limitata disponibilità e le piccole dimensioni del tessuto intestinale primario isolato da neonati umani. Il tessuto intestinale resecato dai neonati con NEC è spesso necrotico e gravemente danneggiato, il che complica gli studi sui meccanismi che precedono l’insorgenza della malattia. Ad esempio, l’intestino tenue dei neonati con NEC è inondato di cellule immunitarie e si osservano anche un numero ridotto di cellule staminali intestinali, una diminuzione della proliferazione delle cellule epiteliali e un aumento dell’apoptosi delle cellule epiteliali 4,5,6,7. Ciò comporta difficoltà nella coltura di cellule epiteliali intestinali da questi campioni e nell’isolamento di RNA e proteine, che possono essere degradate in questo ambiente infiammatorio ostile. Inoltre, poiché il processo della malattia è già avanzato nei neonati con NEC chirurgica, gli studi meccanicistici sui fattori che inducono la malattia non sono fattibili. Queste limitazioni hanno portato a fare affidamento su modelli animali per gli studi meccanicistici della NEC.

Sono stati stabiliti modelli animali di NEC per topi, ratti, suinetti, conigli e babbuini 5,8,9,11. Un punto di forza dei modelli animali è che la malattia intestinale simile alla NEC è indotta da fattori associati all’insorgenza della NEC nell’uomo, tra cui un microbioma disbiotico, ripetuti episodi di ipossia e l’assenza di poppate da latte materno 5,8,10,11. Inoltre, la risposta infiammatoria e i cambiamenti patologici osservati durante la NEC sperimentale sono paralleli alla malattia umana ^5,9,12. Mentre questi modelli imitano molte delle caratteristiche della NEC umana, ci sono differenze intrinseche tra la fisiopatologia della NEC negli animali e nell’uomo. Ad esempio, il modello murino di NEC è indotto in topi nati a termine e, sebbene il loro sviluppo intestinale sia incompleto, la fisiopatologia di NEC è intrinsecamente diversa in questo contesto clinico. L’espressione genica intestinale murina alla nascita è simile a quella di un feto umano pre-vitale e non si avvicina a quella di un neonato pretermine di 22-24 settimane di gestazione fino al giorno 14 (P14)¹³. Questo confonde il modello murino di NEC perché il danno intestinale non può generalmente essere indotto nei topi dopo P10. Inoltre, i ceppi consanguinei di topi mancano della diversità immunologica¹⁴ e microbiologica dei neonati umani¹⁵, che funge da altro fattore confondente. Pertanto, una maggiore incorporazione di campioni umani primari nella ricerca NEC migliora la rilevanza clinica degli studi in questo campo.

Gli studi sui meccanismi del NEC in vitro hanno tradizionalmente utilizzato linee cellulari monotipiche derivate da cellule tumorali intestinali adulte, come le cellule di adenocarcinoma colorettale (Caco2) e adenocarcinoma del colon umano (HT-29)¹⁶. Questi modelli sono convenienti ma limitati nella rilevanza fisiologica a causa della loro crescita da cellule tumorali adulte, dell’architettura non polarizzata e dei cambiamenti fenotipici legati a passaggi ripetuti in coltura. Gli enteroidi intestinali migliorano questi modelli poiché possono essere cresciuti dalle cripte del tessuto intestinale, differenziati in tutti i sottotipi epiteliali intestinali e formare una struttura tridimensionale (3D) simile a villi^17,18,19,20. Recentemente, gli enteroidi intestinali sono stati combinati con la tecnologia microfluidica per sviluppare un modello di intestino tenue su chip e fornire un sistema modello in vitro fisiologicamente più rilevante²¹.

I primi dispositivi microfluidici organ-on-a-chip sono stati introdotti nei primi anni 2000^22,23,24. Il primo modello organ-on-a-chip è stato il respiratore umano lung-on-a-chip²⁵. Questo è stato seguito da numerosi modelli monoorgano come l’intestino²¹, il fegato²⁶, i reni²⁷, il midollo osseo 28, la barriera emato-encefalica²⁹ e il cuore³⁰. Questi modelli organ-on-a-chip sono stati utilizzati per studiare malattie acute, croniche e rare, tra cui la sindrome acuta da ^{radiazioni,31} la broncopneumopatia cronica ostruttiva32 e le malattie neurodegenerative33. La natura polarizzata delle cellule su questi chip e la presenza di due compartimenti cellulari separati da una membrana porosa consente la modellazione di processi fisiologici complessi come la perfusione, i gradienti di concentrazione chimica e la chemiotassi delle cellule immunitarie^34,35. Questi sistemi microfluidici forniscono quindi un nuovo strumento per studiare la fisiopatologia e i meccanismi delle malattie umane.

Il modello di intestino tenue su chip è stato descritto da Kasendra et al. nel 2018, che hanno utilizzato campioni di biopsia intestinale tenue pediatrici (di età compresa tra 10 e 14 anni) differenziati in enteroidi e coltivati su un dispositivo microfluidico²¹. In questo modello sono state incorporate anche le cellule endoteliali vascolari, il flusso continuo dei terreni e l’allungamento/rilassamento. Hanno osservato la differenziazione del sottotipo epiteliale intestinale, la formazione di assi simili a villi 3D, la produzione di muco e i modelli di espressione genica dell’intestino tenue²¹. Questo modello microfluidico è stato applicato alle malattie neonatali con lo sviluppo del sistema NEC-on-a-chip, che incorpora enteroidi intestinali neonatali, cellule endoteliali e il microbioma di un neonato con NEC³⁶. NEC-on-a-chip ricapitola molte delle caratteristiche critiche del NEC umano, tra cui l’espressione genica infiammatoria, la perdita di cellule epiteliali specializzate e la ridotta funzione di barriera intestinale³⁶. Pertanto, questo modello ha numerose applicazioni nello studio della NEC, compresi gli studi meccanicistici e la scoperta di farmaci. In questo manoscritto, viene fornito un protocollo dettagliato per le prestazioni del modello NEC-on-a-chip.

Protocol

Gli enteroidi sono stati derivati da campioni di intestino tenue di neonati prematuri (nati a 22-36 settimane di gestazione) ottenuti al momento dell’intervento chirurgico per NEC o altre condizioni intestinali con eziologie non infiammatorie. Tutta la raccolta e l’elaborazione dei campioni sono state eseguite dopo il consenso informato e l’approvazione da parte degli Institutional Review Boards della Washington University di St. Louis (numeri di protocollo IRB 201706182 e 201804040) e dell’Università della Carolina del…

Representative Results

Gli enteroidi sono stati seminati sul dispositivo microfluidico (Figura 1) e coltivati come descritto sopra. La crescita degli enteroidi nell’idrogel della matrice di coltura cellulare prima della semina e quindi la successiva espansione del monostrato di cellule epiteliali intestinali dopo la semina del dispositivo sono state monitorate tramite microscopia in campo chiaro (Figura 2). Un monostrato di cellule epiteliali intestinali confluenti si è formato e suc…

Discussion

Questo sistema NEC-on-a-chip è un nuovo potente strumento che può essere utilizzato per modellare la fisiopatologia del NEC. Questa piattaforma fornisce un microambiente complesso che assomiglia più da vicino all’ambiente intestinale in vivo rispetto ai modelli precedenti, incorporando un sistema di co-coltura con flusso luminale continuo e allungamento. Queste condizioni promuovono lo sviluppo di un’architettura simile a un villo 3D rivestito da un epitelio altamente polarizzato costituito da sottotipi epite…

Materials

[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A