Summary
Detta protokoll beskriver stegen för att använda den automatiserade plattformen Lustro för att utföra karakterisering av optogenetiska system i jäst med hög genomströmning.
Abstract
Optogenetik erbjuder exakt kontroll över cellulärt beteende genom att använda genetiskt kodade ljuskänsliga proteiner. Att optimera dessa system för att uppnå önskad funktionalitet kräver dock ofta flera design-build-test-cykler, vilket kan vara tidskrävande och arbetskrävande. För att möta denna utmaning har vi utvecklat Lustro, en plattform som kombinerar ljusstimulering med laboratorieautomation, vilket möjliggör effektiv screening och karakterisering av optogenetiska system med hög genomströmning.
Lustro använder en automatiserad arbetsstation utrustad med en belysningsanordning, en skakanordning och en plattläsare. Genom att använda en robotarm automatiserar Lustro förflyttningen av en mikrobrunnsplatta mellan dessa enheter, vilket möjliggör stimulering av optogenetiska stammar och mätning av deras svar. Detta protokoll ger en steg-för-steg-guide om hur man använder Lustro för att karakterisera optogenetiska system för kontroll av genuttryck i den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. Protokollet täcker installationen av Lustros komponenter, inklusive integrationen av belysningsenheten med automationsarbetsstationen. Den ger också detaljerade instruktioner för programmering av belysningsanordningen, plattläsaren och roboten, vilket säkerställer smidig drift och datainsamling under hela experimentprocessen.
Introduction
Optogenetik är en kraftfull teknik som använder ljuskänsliga proteiner för att kontrollera cellernas beteende med hög precision 1,2,3. Att ta fram prototyper av optogenetiska konstruktioner och identifiera optimala belysningsförhållanden kan dock vara tidskrävande, vilket gör det svårt att optimera optogenetiska system 4,5. Metoder med hög genomströmning för att snabbt screena och karakterisera aktiviteten hos optogenetiska system kan påskynda design-build-test-cykeln för prototyper av konstruktioner och utforska deras funktion.
Lustro-plattformen utvecklades som en laboratorieautomatiseringsteknik utformad för screening och karakterisering av optogenetiska system med hög genomströmning. Den integrerar en mikroplattläsare, belysningsanordning och skakanordning med en automatiseringsarbetsstation6. Lustro kombinerar automatiserad odling och ljusstimulering av celler i mikrobrunnsplattor (Figur 1 och Kompletterande Figur 1), vilket möjliggör snabb screening och jämförelse av olika optogenetiska system. Lustro-plattformen är mycket anpassningsbar och kan generaliseras för att fungera med andra laboratorieautomationsrobotar, belysningsenheter, plattläsare, celltyper och optogenetiska system, inklusive de som reagerar på olika våglängder av ljus.
Detta protokoll visar installationen och användningen av Lustro för att karakterisera ett optogenetiskt system. Optogenetisk kontroll av delade transkriptionsfaktorer i jäst används som ett exempelsystem för att illustrera plattformens funktion och användbarhet genom att undersöka förhållandet mellan ljusinsläpp och uttrycket av en fluorescerande reportergen, mScarlet-I7. Genom att följa detta protokoll kan forskare effektivisera optimeringen av optogenetiska system och påskynda upptäckten av nya strategier för dynamisk kontroll av biologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Jäststammarna som används i denna studie dokumenteras i materialtabellen. Dessa stammar uppvisar robust tillväxt inom temperaturintervallet 22 °C till 30 °C och kan odlas i olika vanliga jästmedier.
1. Ställa in automatiseringsarbetsstationen
- Utrusta den automatiserade arbetsstationen med en robotgriparm (RGA, se materialtabell) som kan flytta mikrobrunnsplattor (figur 1).
- Installera en shaker med mikroplattvärme (se materialtabell) i den automatiserade arbetsstationen (Figur 1(1)) med en automatisk plattlåsningsmekanism som ger RGA-åtkomst.
- Placera en mikroplattläsare intill den automatiserade arbetsstationen (figur 1(2) för att säkerställa RGA-åtkomst.
- Inkludera en belysningsanordning för mikroplattor (figur 1(3)) som möjliggör bekväm RGA-åtkomst. Exempel på detta är optoPlate8 (som används i denna studie) eller LITOS9 (se materialförteckning).
2. Förberedelse av belysningsanordningen
- Konstruera och kalibrera optoplattan (eller alternativ belysningsanordning) enligt etablerade metoder 8,10,11.
- Använd en adapter på belysningsenheten för att aktivera RGA-åtkomst.
- Programmera optoPlate med hjälp av en kalkylbladsingång10 eller ett grafiskt gränssnitt12. Följ steg 3 för att utföra ljusstimuleringsprogrammen.
3. Utforma ett ljusstimuleringsprogram
- Bestäm de önskade ljusförhållandena för experimentet.
- Ange önskade ljusförhållanden, inklusive ljusintensitet, ljusets starttid, pulslängd, pulsnummer och interpulslängd, i ett kalkylblad.
OBS: Flasha denna information på optoPlate med hjälp av instruktionerna i GitHub-arkivet: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Kom ihåg att provplattan inte kommer att lysa när den är i mikroplattläsaren eller på värmeskakaren. Varaktigheten och frekvensen för dessa händelser kan kräva optimering baserat på specifika experimentella krav. - Inkludera mörka förhållanden för varje stam för att möjliggöra korrekta bakgrundsmätningar.
- För inledande karakteriseringsexperiment för att bedöma transformantfunktionalitet, använd en hög ljusintensitet.
OBS: Ljusintensiteten bör optimeras för känsligare experiment, eftersom överdrivet ljus kan vara fototoxiskt för jäst13.
4. Förberedelse av mikroplattläsaren
- Konfigurera mikroplattläsaren så att den mäter önskad mängd av intresse innan du utför experiment.
OBS: I det här exemplet konfigurerades mikroplattläsaren för att mäta fluorescens från en rapportör som uttrycktes av den berörda stammen. Andra utgångar, såsom luminiscens eller optisk densitet, kan användas beroende på de experimentella kraven. - Odla den aktuella stammen (tillsammans med en icke-fluorescerande kontroll) i syntetiskt komplett (SC) media14 (eller annat medium med låg fluorescens) (se materialtabell) till den högsta celldensitet som ska mätas. Överför kulturerna till en mikrobrunnsplatta med svart botten (se materialförteckning) och mät dem för att bestämma de optimala inställningarna för mikroplattläsaren.
OBS: Säkerställ korrekta avläsningar genom att korrekt ange plattans mått och mäta plattan underifrån. - Se en databas för fluorescerande proteiner (t.ex. fpbase.org) för att få ungefärliga absorptions- och emissionsspektra för det fluorescerande målproteinet15.
- Bestäm z-värdet (avståndet mellan plattan och läsaren) genom att utföra en z-skanning på brunnar som innehåller de fluorescerande och icke-fluorescerande stammarna. Välj det z-värde som ger det högsta signal-brusförhållandet.
- Optimera absorptions- och emissionsspektra genom att utföra absorptions- och emissionsskanningar på de fluorescerande och icke-fluorescerande stammarna för att bestämma det optimala signal-brusförhållandet.
- Mät den fluorescerande töjningen med förstärkningen inställd på optimal nivå, bestäm den högsta optiska förstärkningen som kan användas utan att resultera i ett överflödesmätningsfel.
OBS: Denna optiska förstärkning bör ställas in manuellt konsekvent över experiment som involverar samma stam för att säkerställa konsekventa resultat. - Förbered ett mätskript (se figur 2) i programvaran för mikroplattläsare. Detta skript konfigurerar instrumentet för att mäta den optiska densiteten hos kulturerna och fluorescensspektra för alla fluorescerande proteiner som ska mätas.
OBS: Mät den optiska densiteten hos stammar vid 600 nm om de inte uttrycker röda fluorescerande proteiner. För stammar som uttrycker röda fluorescerande proteiner, mät den optiska densiteten vid 700 nm för att undvika bias16. - Ställ in mätskriptet så att det håller en intern inkubationstemperatur på 30 °C under mätningarna.
- Konfigurera måttskriptet för att exportera data till ett kalkylblad eller ASCII-filer, enligt önskemål.
5. Programmering av roboten
- Konfigurera arbetsbordsdefinitionen i den automatiserade arbetsstationsprogramvaran baserat på den fysiska layouten för bärare (t.ex. värmeskakare, boplattformar, belysningsanordningar) och laboratorieutrustningen (t.ex. 96-hålsplattan) (se materialförteckning). Skapa ett skript i programvaran för automatiseringsarbetsstationen för att utföra ljusinduktion och mätningar (figur 3) genom att följa stegen nedan.
- Inaktivera alla interna belysningskällor för att förhindra bakgrundsaktivering av optogenetiska system.
- Ställ in värmeskakaren så att den håller en temperatur på 30 °C. När plattan inte är på värmeshakern kommer den att ha omgivningstemperatur (22 °C).
- Använd loopar, en timer och en loopräkningsvariabel för att upprepa stegen för att inducera och mäta cellerna med jämna mellanrum.
- Innan du registrerar mätningar, skaka sample plattan för att säkerställa korrekt suspension av alla celler. En skakning på 60 s vid 1 000 varv per minut med en orbital på 2 mm är i allmänhet tillräcklig för att återsuspendera S288C S. cerevisiae-celler och undvika mätbias.
- Flytta sample plattan till mikroplattläsaren med hjälp av robotarmen och ta bort locket (om tillämpligt) för att förhindra bias i optisk densitetsmätning. Kontrollprogramvaran kommer automatiskt att ta bort och sätta tillbaka locket till den angivna positionen om definitionen av mikroplattläsarens bärare är inställd på att inte tillåta lock.
- Utför mätskriptet för mikroplattläsaren enligt beskrivningen i steg 4.
- Sätt tillbaka locket på sample plattan och flytta plattan till belysningsanordningen med hjälp av robotarmen.
- Ställ in skriptet så att det väntar tills timern når det angivna tidsintervallet (t.ex. 30 min multiplicerat med loopräkningsvariabeln) och upprepa sedan hela loopen för önskat antal iterationer (t.ex. 48 gånger för ett 24-timmarsexperiment).
- Felsök potentiella fel och se till att bärar- och laboratoriedefinitionerna fungerar korrekt, samt RGA:s förmåga att korrekt plocka upp och placera plattan genom att köra en tom platta genom skriptslingan flera gånger.
- Konfigurera användarvarningar för att meddela användaren om eventuella ändringar eller fel i instrumenttillståndet som kan uppstå under körningen av protokollet.
6. Ställa in provplattan
- Odla jäststammar på rich media-plattor, såsom YPD-agar17 (se materialtabell). Inkludera en icke-fluorescerande (negativ) kontroll.
- Välj kolonier från plattorna och inokulera dem i 3 ml SC-media14 (eller annat lågfluorescensmedium, t.ex. LFM18) i glasodlingsrör. Inkubera kulturerna över natten vid 30 °C på en rulltrumma och förvara dem i mörker eller under ljusförhållanden som inte reagerar (t.ex. rött ljus för system med blått ljus).
- Mät den optiska densiteten hos nattodlingarna genom att späda 200 μl av varje odling i 1 ml SC-media och registrera den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) med hjälp av en spektrofotometer eller mikroplattläsare.
- Späd varje nattkultur till en OD600 på 0,1 i glasodlingsrör. För töjningstestning med högre genomströmning, utför automatiserade utspädningar i mikrobrunnsplattor.
- Pipettera de utspädda kulturerna i plattan med 96 brunnar. Inkludera tre brunnar för varje tillstånd (dvs. tre identiska brunnar med samma töjning och ljustillstånd) för att ta hänsyn till tekniska variationer. Inkludera brunnar med tomma medier och icke-fluorescerande celler som negativa kontroller för att mäta bakgrundsfluorescens och optisk densitet.
- Inkubera plattan vid 30 °C under omskakning i 5 timmar innan ljusinduktionsexperimentet påbörjas. Justera utspädningsmängderna och inkubationstiderna efter behov för att optimera för specifika stammar och experimentella förhållanden.
7. Utföra experimentet
- Placera sample plattan på värmeskakaren och initiera automatiseringsskriptet enligt beskrivningen i steg 5.
- Starta ljusstimuleringsprogrammet enligt beskrivningen i steg 3 när den första mätningen på plattläsaren har registrerats.
- Om automationsarbetsstationen inte står i ett mörkt rum, täck den med en mörkläggningsgardin för att undvika bakgrundsbelysning.
8. Analys av data
- Skapa en kalkylbladskarta för experimentet, som återspeglar layouten på 8 x 12 för plattan med 96 brunnar. Se till att kartan innehåller namnen på de stammar som mäts i ett rutnät och beskrivningar av ljusförhållandena som används i ett annat rutnät.
- Använd ett Python-skript eller ett annat föredraget programmeringsspråk för att analysera exporterade data. Importera kartkalkylbladet till en matris och associera stamnamnen och tillståndsnamnen med varje brunn på plattan.
OBS: Exempelkod för analys finns på: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativt kan man använda en applikation för att analysera data från olika plattläsare19. - Läs data från det exporterade experimentkalkylbladet till en annan matris.
- Generera diagram över de optiska densitetsvärdena och fluorescensvärdena för varje stam och tillstånd över tid, som illustreras i figur 4.
- Undersök de optiska densitetsdiagrammen för att bestämma stadierna av exponentiell tillväxt eller mättnad i kulturerna. Denna information kommer att hjälpa till att välja lämpliga tidpunkter för att jämföra fluorescensmätningar mellan stammar eller förhållanden, som visas i figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4A visar fluorescensvärdena över tid för en optogenetisk stam som uttrycker en fluorescerande rapportör som styrs av en ljusinducerbar delad transkriptionsfaktor. De olika ljusförhållandena som används i experimentet återspeglas av variationer i arbetscykeln, som representerar den procentandel av tiden som ljuset är på. Den totala fluorescensnivån observeras vara proportionell mot ljusstimuleringens arbetscykel. Figur 4B visar motsvarande OD700-värden för samma experiment. Konsistensen av de optiska densitetsavläsningarna över olika ljusförhållanden tyder på att den experimentella tekniken inte signifikant påverkar stammarnas tillväxthastighet under varierande ljusförhållanden.
Genom att mäta fluorescens och optisk densitet över tid kan man få en djupare förståelse för hur optogenetiska system svarar på olika ljusstimuleringsprogram jämfört med tekniker som bara fångar upp utstrålning vid en enda tidpunkt. Dessa tidsförloppsdata är värdefulla för att välja specifika tidpunkter för att jämföra olika stammar och förhållanden. Figur 5 illustrerar en enda tidpunkt (mätt vid 10 timmar in i ljusinduktionen) för två distinkta optogenetiska stammar inducerade av olika ljusstimuleringsprogram. Båda stammarna använder en ljusinducerbar delad transkriptionsfaktor för att driva uttrycket hos en fluorescerande reporter. Variationer i ljuspulsintensitet, period och arbetscykel framkallar olika svar hos dessa stammar.
Bild 1: Arbetstabelllayout och experimentellt arbetsflöde. Skärmdump av ett exempel på arbetsbordslayout, som anger provplattans rörelse i Lustro. Plattan flyttas av robotarmen från en värmeskakare (1) till mikroplattläsaren (2) och sedan till belysningsanordningen (3). Fotografier finns i kompletterande figur 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Mätskript för plattläsare. Exempel på skärmdump av ett plattläsarskript som ställer in mikroplattläsaren så att den inkuberas vid 30 °C och registrerar fluorescens- och optiska densitetsmätningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Automatiserat arbetsstationsskript. Exempel på skärmdump av ett automatiserat arbetsstationsskript för Lustro. Skriptet startar en timer, ser till att innerbelysningen är avstängd, ställer in en slingräkningsvariabel till ett initialt värde på 0 och ställer in värmeskakaren så att den inkuberar vid 30 °C. Inom varje slinga låses plattan, skakas i 1 minut, flyttas till plattläsaren, mäts och flyttas sedan till belysningsanordningen, och roboten är inställd på att vänta på resten av det 30 minuter långa slingintervallet. I slutet av denna tid ökas loopräknarvariabeln med ett och loopen upprepas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kurs för induktionstid. Sample ljusinduktionstidsförloppsdata från en Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD delad transkriptionsfaktorstam med en pGAL1-mScarlet-I-reporter (yMM17346). Fluorescensen för mScarlet-I7 mäts vid 563 nm excitation och 606 nm emission med en optisk förstärkning på 130. Ljusintensiteten är 125 μW/cm2 och felstaplarna representerar standardfelet för tre prover. Den lodräta röda streckade linjen visar när kulturerna når mättnad. (A) Fluorescensvärden från stammen över tiden. Ljusmönster (enligt anvisningarna) upprepades under hela det visade experimentet. Infällningen visar att ljusa pulstider varvas med mörka interpulstider, vilket upprepas genom hela undersökningen. (B) Värden för optisk densitet (uppmätt vid 700 nm) för det experiment som visas i (A). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av olika optogenetiska system. Jämförelse av olika ljusinduktionsprogram mellan CRY2(535)/CIB1 och eMagA/eMagBM delade transkriptionsfaktorstammar med pGAL1-mScarlet-I-reportrar (yMM1763 respektive yMM17656). Fluorescensen för mScarlet-I7 mäts vid 563 nm excitation och 606 nm emission med en optisk förstärkning på 130. Ljusintensiteten som används är 125 μW/cm2, om inget annat anges. Felstaplar representerar standardfelet för tre exemplar (anges som punkter). Fluorescensvärdena som visades registrerades 10 timmar efter induktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Representativa bilder av de enheter som används i Lustro. Bild på Lustro-installationen och inzoomade bilder på de enheter som används. Robotarmen flyttar provplattan från värmeskakaren till plattläsaren och sedan till belysningsanordningen i en cykel under hela experimentet. Komponenterna är numrerade med en förklaring på sidan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lustro-protokollet som presenteras här automatiserar odlings-, belysnings- och mätprocesserna, vilket möjliggör screening med hög genomströmning och karakterisering av optogenetiska system6. Detta uppnås genom att integrera en belysningsanordning, en mikroplattläsare och en skakanordning i en automatiserad arbetsstation. Detta protokoll visar specifikt Lusiros användbarhet för screening av olika optogenetiska konstruktioner integrerade i jästen S. cerevisiae och jämförelse av ljusinduktionsprogram.
Flera viktiga steg som betonas i detta protokoll är avgörande för ett effektivt utnyttjande av Lustro. Noggrann design av skräddarsydda ljusprogram som överensstämmer med kinetiken för den optogenetiska konstruktionen som undersöks är nödvändig. Dessutom är exakt kalibrering av plattläsaren avgörande för att få tillförlitliga mätningar. Noggranna testkörningar av experimenten på roboten, inklusive nödvändiga justeringar för att säkerställa korrekt synkronisering med ljusprogrammen, är avgörande för att säkerställa att skriptet fungerar smidigt.
Provprotokollet som tillhandahålls här beskriver jämförelsen av en ljusinducerbar delad transkriptionsfaktor som driver uttrycket av en fluorescerande rapportör till en icke-fluorescerande kontroll under olika ljusstimuleringsförhållanden. Fluorescensmätningar görs från varje brunn i plattan med 30 minuters intervall, vilket föregås av 1 minuts skakning på värmeskakern före mätningen. Som visas i detta protokoll är Lustro lämplig för användning med optogenetiska system som reagerar på blått ljus och som är integrerade i icke-vidhäftande celltyper, inklusive bakterier och andra jästsvampar. Men med mindre modifieringar kan protokollet enkelt utvidgas till olika celltyper, optogenetiska system och experimentell design. Justeringar av plattläsarens inställningar skulle möjliggöra mätning av andra utgångar än fluorescens, såsom bioluminiscens. För applikationer som kräver finare tidsupplösning kan mätningar göras oftare. Inkubationen på värmeskakaren kan upprepas oftare när det är kritiskt för specifika celltyper som kräver skakning och temperaturkontroll. Inkorporering av gas och miljökontroll, t.ex. genom ett inkuberat hotell, skulle göra det möjligt att inkludera däggdjurscellinjer. Medan iterationen av Lustro som beskrivs här använder specifik instrumentering, kan Lustro-plattformen enkelt anpassas för att fungera med andra laboratorieautomationsrobotar eller mikroplattläsare. Belysningsanordningar, som LPA20 eller LITOS9, kan ersätta optoplattan för att stimulera olika optogenetiska system. En framtida modifiering av Lustro-plattformen skulle kunna innebära att man införlivar vätskehantering för att underlätta automatiserade utspädningar för kontinuerliga odlingsapplikationer. Detta skulle också göra det möjligt att anpassa Lustro för cybergenetisk återkopplingskontroll, där realtidsmätningar informerar om förändringar i ljus- eller odlingsförhållanden för att uppnå eller bibehålla en önskad respons 5,21,22.
Tekniker med hög genomströmning är avgörande för att optimera och utnyttja den dynamiska karaktären hos optogenetiska system. Lustro övervinner många begränsningar i befintliga protokoll. Till exempel, medan bioreaktorbaserade optogenetiktekniker möjliggör konstant avläsning och odlingsförhållanden, lider de av låg genomströmning23,24,25,26. optoPlateReader27-enheten är lovande för optogenetikexperiment i realtid i mikrobrunnsplattor, men har för närvarande låg genomströmning på grund av behovet av ett stort antal replikat för att få tillförlitliga resultat och ger inte tillgång till kontinuerlig odling. Lustro, å andra sidan, möjliggör screening av optogenetiska system med hög genomströmning för att karakterisera deras dynamiska aktivitet. Ändå finns det vissa begränsningar i Lustro-protokollet. Intermittent skakning i Lustro orsakar en liten tillväxtfördröjning för jästceller6, men detta kan åtgärdas genom att anpassa en belysningsanordning för att införliva skakning. En annan begränsning med Lustro-systemet är att provplattan inte inkuberas medan den är på belysningsanordningen och hålls vid omgivningstemperatur (22 °C). Även om den lilla volymen av varje prov möjliggör skärmar med hög genomströmning, kan ytterligare optimering av belysningsstegen vara nödvändig vid skalning till större reaktionsvolymer för bioproduktion eller andra applikationer28,29.
Sammantaget underlättar Lustro snabb utveckling och testning av optogenetiska system genom screening med hög genomströmning och exakt ljuskontroll. Detta automatiserade tillvägagångssätt möjliggör effektiv karakterisering och jämförelse av olika optogenetiska konstruktioner under olika induktionsförhållanden, vilket leder till snabbare iteration och förfining av dessa system. Med sin anpassningsförmåga till olika celltyper, optogenetiska verktyg och automatiseringsinställningar banar Lustro väg för framsteg inom optogenetik, vilket underlättar utforskningen av dynamisk genuttryckskontroll och utökar möjligheterna att studera biologiska nätverk och konstruera cellulärt beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-anslaget R35GM128873 och National Science Foundation-anslaget 2045493 (tilldelat M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. har ett karriärpris vid Scientific Interface från Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. stöddes av ett NHGRI-utbildningsbidrag till Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi är tacksamma för givande diskussioner med McCleans labbmedlemmar, och i synnerhet är vi tacksamma mot Kieran Sweeney för att ha gett kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
