Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas
Summary
Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.
Abstract
Os organoides renais podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de várias abordagens. Esses organoides são uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e potenciais aplicações terapêuticas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para a criação de organoides renais a partir de iPSCs, partindo da estria primitiva posterior (SP) até o mesoderma intermediário (IM). A abordagem baseia-se no meio APEL 2, que é um meio definido e livre de componentes animais. É suplementado com uma alta concentração de agonista WNT (CHIR99021) por uma duração de 4 dias, seguido por fator de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina e uma baixa concentração de CHIR99021 por mais 3 dias. Durante esse processo, ênfase é dada à seleção da densidade celular e da concentração CHIR99021 ideais no início das iPSCs, pois esses fatores são críticos para o sucesso da geração de organoides renais. Um aspecto importante desse protocolo é a cultura da suspensão em placa de baixa aderência, permitindo que o MI evolua gradualmente para estruturas néfrons, englobando estruturas glomerulares, tubulares proximais e tubulares distais, todas apresentadas em um formato visualmente compreensível. Em geral, este protocolo detalhado oferece uma técnica eficiente e específica para produzir organoides renais a partir de diversas iPSCs, garantindo resultados bem-sucedidos e consistentes.
Introduction
O rim desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase fisiológica, dependendo de sua unidade funcional. Néfrons, que excretam produtos residuais, podem regular a composição dos fluidos corporais. A doença renal crônica (DRC), causada por mutações hereditárias ou outros fatores de alto risco, eventualmente evoluirá para doença renal terminal (DRCT)1,2. A DRCT é aparentemente devida à limitada capacidade de regeneração dos néfrons. Assim, a terapia renal substitutiva é necessária. A diferenciação dirigida de iPSCs humanas permite a geração in vitro de organoides renais 3D específicos para o paciente, que podem ser usados para estudar o desenvolvimento renal, modelar doenças específicas do paciente e realizar triagem de drogas nefrotóxicas 3,4.
Durante o desenvolvimento embrionário, os rins originam-se do mesoderma intermediário (IM), que se diferencia da estria primitiva (SP). A via de sinalização WNT clássica pode induzir diferenciação adicional de MI com a participação coordenada de FGF (FGF9, FGF20) e BMP (sinalização Bmp7 através de JNK)5,6,7. Produzem duas importantes populações celulares de células progenitoras nefrônicas (NPC): o broto ureteral (UB) e o mesênquima metanéfrico (MM), formando os ductos coletores e o néfron, respectivamente 8,9. Cada néfron é composto por segmentos glomerulares e tubulares, como os túbulos proximal e distal, e a alça de Henle10,11. De acordo com a teoria mencionada acima, os protocolos atualmente publicados mimetizam as cascatas de sinal e a estimulação do fator de crescimento para induzir organoides renais5,12.
Nos últimos anos, muitos protocolos foram desenvolvidos para diferenciar iPSCs humanas em organoides renais 5,6,7,12. Takasato et al.7 otimizaram a duração do tratamento com CHIR (agonista WNT) antes da reposição por FGF9. De acordo com seu protocolo, a exposição a CHIR por 4 dias, seguida de FGF9 por 3 dias, é a maneira mais eficaz de induzir IM a partir de iPSCs. Filtros transwell foram utilizados como formato de cultura em seu procedimento; no entanto, este método é difícil para iniciantes. Por isso, Kumar et al.13 tentaram mudar o formato da cultura e optaram por suspendê-la. Eles dissociaram as células aderentes no Dia 7 para semeadura em placas de baixa aderência para ajudá-las a se agrupar em corpos embrionários (EBs) que contêm estruturas semelhantes a néfrons. No entanto, o efeito em lote desses métodos foi aparente, especialmente em diferentes iPSCs. Além disso, diferentes literaturas relataram que a concentração de CHIR variou de 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Especulamos que a concentração da densidade celular e o CHIR poderiam afetar a geração de organoides em diferentes iPSCs, e isso foi verificado inúmeras vezes em nossos experimentos. O presente protocolo modificou um pouco o método de estudo de Kumar et al.13 e forneceu aos usuários um procedimento passo a passo. O cronograma e o esquema da abordagem são mostrados na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo detalhado foi descrito para a geração de organoides renais a partir de iPSCs, envolvendo pequenas modificações no meio basal, densidade celular inicial e concentração de CHIR99021. Em vários experimentos, os fatores críticos para o sucesso da geração de organoides renais foram a diferenciação inicial do mesoderma intermediário (IM) e o estado celular no Dia 7. Além disso, diferentes linhagens de iPSC exibiram variações na proliferação celular e potencial de diferenciação, resultando em de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos extremamente gratos a todos os membros do Mao e Hu Lab, do passado e do presente, pelas interessantes discussões e grandes contribuições para o projeto. Agradecemos ao National Clinical Research Center for Child Health pelo grande apoio. Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U20A20351 para Jianhua Mao, 82200784 para Lidan Hu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang da China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) e a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Subsídios nº. BK20210150 para Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. 발생학. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
