Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Identifiera, diagnostisera och gradera maligna perifera nervskidetumörer i genetiskt modifierade musmodeller

Published: May 17, 2024 doi: 10.3791/65740
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

Summary

Vi har utvecklat en metod för att bedöma om tumörer i nervsystemet hos genetiskt modifierade möss korrekt rekapitulerar patologin hos sina mänskliga motsvarigheter. Här tillämpar vi dessa histologiska tekniker, definierade patologiska kriterier och odlingsmetoder på neurofibrom och maligna perifera nervskidtumörer som uppstår i P 0-GGFβ3-musmodellen.

Abstract

Patienter med det autosomalt dominanta tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1) utvecklar vanligtvis plexiforma neurofibrom (PN) som därefter omvandlas till mycket aggressiva maligna perifera nervskidetumörer (MPNST). Att förstå processen genom vilken en PN omvandlas till en MPNST skulle underlättas av tillgängligheten av genetiskt modifierade musmodeller (GEM) som exakt replikerar PN-MPNST-progressionen som ses hos människor med NF1. Tyvärr rekapitulerar inte GEM-modeller med Nf1-ablation helt och hållet denna process. Detta ledde oss till att utveckla P 0-GGFβ3-möss, en GEM-modell där överuttryck av Schwann-cellens mitogen neuregulin-1 (NRG1) i Schwann-celler resulterar i utveckling av PN som utvecklas till att bli MPNST med hög frekvens. Men för att avgöra om tumörgenes och neoplastisk progression hos P 0-GGFβ3-möss korrekt modellerar de processer som ses hos NF1-patienter, var vi tvungna att först bevisa att patologin hos P0-GGFβ3 perifera nervskidetumörer rekapitulerar patologin hos deras mänskliga motsvarigheter.

Här beskriver vi de specialiserade metoder som används för att korrekt diagnostisera och gradera tumörer i perifera nervsystemet i GEM-modeller, med hjälp av P 0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53+/- möss som exempel. Vi beskriver de histologiska, immunhistokemiska och histokemiska metoder som används för att diagnostisera PN och MPNST, hur man skiljer dessa tumörer från andra tumörtyper som efterliknar deras patologi och hur man graderar dessa neoplasmer. Vi diskuterar etablering av tidiga passagekulturer från GEM MPNSTs, hur man karakteriserar dessa kulturer med hjälp av immunocytokemi och hur man verifierar deras tumörigenicitet genom att etablera allograft. Sammantaget karakteriserar dessa tekniker patologin hos PN och MPNST som uppstår i GEM-modeller och jämför kritiskt patologin hos dessa murina tumörer med deras mänskliga motsvarigheter.

Introduction

Under de senaste tre decennierna har många laboratorier försökt skapa musmodeller av mänsklig cancer genom att introducera mänskliga cancerassocierade mutationer i musgenomet eller genom att överuttrycka en genprodukt som överuttrycks i mänsklig cancer. De resulterande genetiskt modifierade musmodellerna (GEM) kan användas för en mängd olika ändamål, såsom att fastställa att den nyligen introducerade genomiska modifieringen initierar tumörbildning, identifiera andra efterföljande genetiska eller epigenetiska förändringar som bidrar till tumörprogression och definiera de viktigaste signalvägarna som driver tumörinitiering och progression. Till skillnad från ortotopiska xenograftmodeller, som bygger på användning av möss med immunbrist, har GEM-cancermodeller ett fullt fungerande immunsystem och modellerar därför mer exakt svar på potentiella terapeutiska medel. Men när man använder GEM-cancermodeller för ändamål som dessa är det viktigt att utredarna bekräftar att observationer som gjorts med GEM-tumörer är relevanta för deras mänskliga motsvarigheter. Denna validering bör innefatta en grundlig bedömning av GEM-neoplasmernas patologi och en bestämning av huruvida de patologiska egenskaperna hos GEM-neoplasmerna rekapitulerar patologin hos motsvarande humana tumörtyp.

Tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1) är den vanligaste genetiska sjukdomen som påverkar det mänskliga nervsystemet och förekommer hos ungefär 1 av 3 000-3 500 levande födda 1,2,3. Individer som drabbas av NF1 utvecklar flera godartade perifera nervskidetumörer som kallas neurofibrom i huden (dermalt neurofibrom) och i stora nerver och nervplexus (plexiforma neurofibrom). Medan både dermala och plexiforma neurofibrom försämrar patientens livskvalitet genom att ge fysiska, beteendemässiga och/eller sociala funktionsnedsättningar, är plexiforma neurofibrom (PN) särskilt farliga 4,5. Detta beror på att PN ofta omvandlas till maligna perifera nervskidetumörer (MPNST), som är aggressiva spindelcellstumörer med en exceptionellt låg överlevnadsgrad 1,2. Till stor del beror denna låga överlevnad på att de radio- och kemoterapeutiska regimer som för närvarande används för att behandla MPNST är ineffektiva. Att utveckla nya, mer effektiva terapier har dock varit utmanande. Detta beror på att, trots hur vanligt MPNST förekommer hos NF1-patienter, är de fortfarande sällsynta tumörer. Som ett resultat är det mycket svårt att få ett stort antal mänskliga tumörer för studier; Det är också en utmaning att rekrytera tillräckligt många patienter med MPNST för kliniska prövningar. För att övervinna dessa begränsningar har flera GEM-modeller genererats med målet att få ytterligare insikter om de avvikelser som driver neurofibrompatogenes och PN-MPNST-progression och för att underlätta prekliniska prövningar med läkemedelskandidater.

NF1-patienter har inaktiverande mutationer i en kopia av NF1-genen. Neurofibrompatogenes utlöses när en inaktiverande mutation i den återstående funktionella NF1-genen inträffar i en cell i Schwann-cellinjen. Förvånansvärt nog utvecklade möss inte neurofibrom 6,7 när de genererades med könscellsinaktiverande Nf1-mutationer. Den efterföljande demonstrationen att möss med Nf1-null Schwann-celler och Nf1-haploinsufficiens i alla andra celltyper (Krox20-Cre;Nf1flox/- möss) utvecklade plexiforma neurofibrom föreslog att reducerad Nf1-gendos i ytterligare celltyper krävdes för neurofibrompatogenes8. Även då, de plexiforma neurofibromerna i Krox20-Cre; Nf1-flox/- möss utvecklades inte till att bli MPNSTs och efterliknade därför bara delvis biologin hos sina mänskliga motsvarigheter. MPNST-patogenes inträffade när Nf1-mutationer parades ihop med mutationer i ytterligare tumörsuppressorgener såsom Trp539 eller Cdkn2a10, men MPNST i dessa GEM-modeller utvecklades de novo eller från atypiska neurofibromatösa neoplasmer med osäker biologisk potential (ANNUBPs)11,12, snarare än från redan existerande benigna plexiforma neurofibrom (se13,14 för utmärkta recensioner av dessa modeller såväl som andra modeller som introducerar ytterligare MPNST-associerade funktionsmutationer i gener som Suz12 och Pten15).

Dessa musmodeller har varit ovärderliga för att fastställa den roll som gener som NF1, TP53 och CDKN2A spelar i patogenesen av NF1-associerade tumörer i perifera nervsystemet och för prekliniska prövningar som testar potentiella terapeutiska medel. Vi har dock fortfarande en ofullständig förståelse för den process genom vilken plexiforma neurofibrom utvecklas till att bli atypiska neurofibromatösa neoplasmer med osäker biologisk potential (ANNUBPs16) och sedan MPNST. Vissa framsteg har nyligen gjorts för att förstå denna process med den senaste rapporten att möss med deletioner i Nf1 och Arf utvecklar ANNUBPs som utvecklas till att bli MPNST11. Det finns dock ännu inga Nf1-mutationsbaserade musmodeller som helt rekapitulerar processen för plexiform neurofibrom-MPNST-progression som ses hos människor. Dessutom är det inte klart om det finns flera distinkta vägar som leder till utvecklingen av MPNST. Med tanke på detta är det möjligt att de GEMs som beskrivs ovan endast modellerar en delmängd av flera olika vägar som leder till neurofibrom-MPNST-progression och MPNST-patogenes. Detta understryks av det faktum att MPNST också förekommer sporadiskt och att vissa sporadiska MPNST uppenbarligen inte har NF1-mutationer 17,18.

Även om den senare punkten har ifrågasatts av Magollon-Lorenz et al.'s senaste förslag att åtminstone några sporadiska MPNST som saknar NF1-mutationer är melanom eller en annan typ av sarkom19, har vi nyligen rapporterat en sporadisk MPNST och en cellinje härledd från denna tumör (2XSB-celler) som var NF1 vildtyp20. Under karakteriseringen av modertumören och 2XSB-cellinjen uteslöt vi systematiskt alternativa diagnostiska möjligheter, inklusive melanom och de många andra sarkomtyper som rutinmässigt beaktas vid differentialdiagnos av en sporadisk malign perifer nervskidetumör20. Dessutom noterar vi att Magollon-Lorenz et al. erkände att deras fynd i de tre sporadiska MPNST-cellinjerna som de studerade inte kunde generaliseras för att indikera att alla tumörer som identifierats som sporadiska MPNST inte är MPNST.

För att konstruera en GEM-modell där neurofibrom och MPNST-patogenes inte nödvändigtvis var beroende av specifika tumörsuppressorgenmutationer, genererade vi transgena möss där överuttryck av den potenta Schwann-cellens mitogen neuregulin-1 (NRG1) drevs av Schwann-cellspecifik myelinprotein noll (P0) promotor (P 0-GGFβ3 möss)21. Vi har tidigare visat att humana neurofibrom, MPNSTs och MPNST-cellinjer uttrycker flera NRG1-isoformer tillsammans med erbB-receptortyrosinkinaser (erbB2, erbB3 och erbB4) som medierar NRG1-signalering och att dessa erbB-receptorer är konstitutivt aktiverade22. Vi har också visat att farmakologiska hämmare av erbB-kinaserna kraftigt hämmar MPNST-proliferation22, överlevnad23 och migration24. I enlighet med våra observationer på människor utvecklar P 0-GGFβ3-möss plexiforma neurofibrom25 som utvecklas till MPNST vid en hög frekvens 21,25. Vi har visat att P 0-GGFβ3 MPNSTs, liksom deras mänskliga motsvarigheter, ofta utvecklar mutationer av Trp53 och Cdkn2a, liksom många andra genomiska abnormiteter som potentiellt bidrar till tumörbildning25. MPNST som uppstår i P 0-GGFβ3-möss har inga inaktiverande Nf1-mutationer. Men med hjälp av genetisk komplementering visade vi att NRG1 främjar tumörbildning hos P 0-GGFβ3-möss huvudsakligen genom samma signalkaskader som förändras av Nf1-förlust 26; denna slutsats är baserad på vår upptäckt att ersätta NRG1-överuttryck för Nf1-förlust i närvaro av Trp53-haploinsufficiens (P 0-GGFβ3;Trp53+/- möss) producerar djur där MPNST utvecklas de novo, vilket ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- möss27.

För att erhålla denna och annan information som visar att P 0-GGFβ3-möss exakt modellerar processerna för neurofibrompatogenes och neurofibrom-MPNST-progression som ses hos människor med NF1, har vi utvecklat specialiserade metoder för bearbetning av vävnader från dessa djur, korrekt diagnostisering av deras tumörer, gradering av MPNST som uppstår i dessa möss, etablering och karakterisering av tidig passage P0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST-kulturer och kritiskt jämföra patologin för P 0-GGFβ3 PN och MPNST och P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST till sina mänskliga motsvarigheter. Många av dessa metoder är generaliserbara till andra GEM-modeller för nervsystemets neoplasi. Dessutom är flera av dessa metoder mer allmänt tillämpliga på GEM-modeller där tumörer uppstår i andra organ. Därför presenterar vi här en detaljerad beskrivning av dessa metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerna som beskrivs här har godkänts av Medical University of South Carolinas IACUC och har utförts av korrekt utbildad personal i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur och MUSC:s riktlinjer för institutionell djurvård.

1. Bestämning av tumörpenetrans och överlevnad i P 0-GGFβ3-möss och identifiering av tumörer hos dessa djur för vidare karakterisering

  1. Generera den kohort av möss som kommer att bedömas för tumörbildning. Antalet möss som krävs beror på tumörfenotypens penetrans. För att kompensera för förluster som dessa, börja med en kohort som är 10-15 % högre än det önskade slutliga antalet djur.
    OBS: Vi bestämde tumörpenetrans i P 0-GGFβ3-möss empiriskt i en initial kohort av 50 möss (varav sex förlorades av skäl som inte är relaterade till neoplasi (t.ex. slagsmål))25.
  2. Bedöm djurens hälsa tre gånger i veckan och registrera kroppskonditionspoäng, inklusive vikt och beteendeförändringar vid varje undersökning. Avliva tumörbärande eller döende möss (se anmärkning nedan) med hjälp av koldioxideutanasi följt av cervikal dislokation. Rekordålder vid dödsfall i dagar. Om tumörerna är synliga utåt, registrera tumörens dimensioner (längd, bredd och höjd).
    OBS: Det är viktigt att djuren inte tillåts gå längre än till den IACUC-godkända högsta tillåtna tumörstorleken och/eller det humana effektmåttet.
  3. Med hjälp av åldern vid döden kan du upprätta en Kaplan-Meier-överlevnadskurva för att bestämma medelåldern vid döden och överlevnadsintervallet.
    OBS: P 0-GGFβ3-möss hade en medelålder vid döden på 261,5 dagar, med ett intervall på 74-533 dagar; 91 % av vår kohort hade multipla neurofibrom och 71 % hade MPNST21.
  4. Bestäm om det finns grovt synliga tumörer och, om de är det, dissekera dem under sterila förhållanden för att fastställa om tumören är associerad med en perifer nerv och ta sedan bort tumören. i P 0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53+/- möss, perifera nervskidas tumörer är vanligast i trigeminus- och ischiasnerverna. Även om grovt synliga tumörer inte ses i samband med dessa nerver, fixera och bädda in dessa nerver enligt beskrivningen nedan så att de kan undersökas för förekomst av mikrotumörer. Mikrotumörer uppstår vanligtvis i ganglierna som är associerade med dessa nerver.
  5. Skär grovt synliga tumörer i tre delar (Figur 1A). Använd del 1 för histologi (paraffinsnitt, immunhistokemi och histokemi). Använd del 2 för att etablera kulturer som passerar tidigt. Snäpp och frys bit 3 (med flytande kväve) för eventuella framtida experiment (t.ex. immunoblots, RNA- och DNA-isolering).
  6. Fixera bit 1 i 4 % paraformaldehyd i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) över natten vid 4 °C. Fixera resten av djurets kropp genom nedsänkning i 4 % paraformaldehyd över natten vid 4 °C.

2. Paraffininbäddning av grovt synliga tumörer och beredning av hematoxylin- och eosinfärgade snitt för initial diagnostisk bedömning

  1. Paraffininbäddning av grovt synliga tumörer
    1. Efter att ha fixerat tumörbit 1 över natten i 4% paraformaldehyd, skölj vävnaden genom att placera den i en volym PBS som är minst 10 gånger större än vävnadens volym i 15 minuter; Använd samma volym för alla efterföljande sköljningar. Upprepa ytterligare två 15 minuters PBS-sköljningar, med en ny volym PBS för varje sköljning.
    2. Överför tumörbit 1 till 70 % etanol. Låt servetten ligga i 70 % etanol i 24 timmar vid 4 °C. Om så önskas, förvara vävnaden under lång tid under dessa förhållanden.
      Anmärkning: Punkterna 2.1.1 till 2.1.7 tillhandahålls till förmån för prövare som inte har tillgång till en kommersiell vävnadsbearbetningsmaskin. Om prövaren har tillgång till en vävnadsprocessor kommer vävnaden att bearbetas genom graderade etanoler och xylener enligt det programmerade instrumentprotokollet.
    3. Överför tumörbit 1 till 80 % etanol i 30 minuter vid rumstemperatur. Upprepa inkubationen i ytterligare 30 minuter i en ny volym 80 % etanol.
    4. Överför tumörbit 1 till 95 % etanol i 75 minuter vid rumstemperatur. Upprepa inkubationen ytterligare två gånger, varje gång i ytterligare 75 minuter i en ny volym av 95 % etanol.
    5. Överför tumörbit 1 till 100 % etanol och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur. Upprepa den 60 minuter långa inkubationen ytterligare två gånger, varje gång med en ny volym 100 % etanol.
    6. Överför tumördel 1 till ett d-limonenbaserat lösningsmedel och inkubera i 30-60 minuter vid rumstemperatur. Överför tumördel 1 till en ny volym av det d-limonenbaserade lösningsmedlet och inkubera i ytterligare 30-60 minuter vid rumstemperatur.
    7. Överför tumördel 1 till 1:1 paraffin/d-limonenbaserad vätska i 1 timme vid 60 °C. Kassera den 1:1 paraffin/d-limonen-baserade spädningsvätskan och överför tumördel 1 till 60 °C paraffin och inkubera i 20 minuter vid 60 °C. Upprepa inkubationen i en ny volym av 60 °C paraffin en gång till i 20 minuter. Inkubera tumörbit 1 i paraffin över natten vid 60 °C.
    8. Häll ett baslager paraffin i en stålhistologiform och låt den stelna. Överför tumörbit 1 till ytan av basparaffinet och omedelbart efter positionering, täck vävnaden med 60 oC paraffin och placera vävnadskassetten ovanpå och i kontakt med det smälta paraffinet. Överför formen till den kalla sidan av inbäddningsstationen och låt den stelna i 10-15 min.
    9. Ta bort paraffinblocket med den bifogade vävnadskassetten från formen. Använd den bifogade vävnadskassetten för att klämma fast blocket i mikrotomen under snittning.
      OBS: Paraffinblocket kan nu förvaras på obestämd tid i rumstemperatur.
  2. Förbered hematoxylin- och eosinfärgade delar av grovt synliga tumörer.
    1. Skär 4-5 μm sektioner av tumörvävnad med hjälp av en mikrotom och montera dem på positivt laddade glasskivor.
    2. För att utföra hematoxylin- och eosinfärgning (H&E), avparaffinisera vävnadssnitten genom att inkubera objektglasen i ett d-limonenbaserat lösningsmedel i 10 minuter vid rumstemperatur. Upprepa inkubationen i en ny volym d-limonenbaserat lösningsmedel i 10 minuter.
    3. Överför glasen till 100 % etanol och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur. Överför objektglasen till en ny volym 100 % etanol och inkubera i ytterligare 5 minuter i rumstemperatur.
    4. Överför objektglasen till 95 % etanol och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur. Överför objektglasen till en ny volym 95 % etanol och inkubera i ytterligare 5 minuter i rumstemperatur.
    5. Överför objektglasen till 70 % etanol och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur. Överför sedan till 50 % etanol och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur.
    6. Överför glasen till destillerat vatten och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur.
    7. Färga objektglasen genom att doppa dem i hematoxylin i 5 minuter i rumstemperatur. Skölj med rinnande kranvatten i 1-2 min. Differentiera genom att doppa objektglas 2-5 gånger i 0,5 % saltsyra i 70 % etanol. Skölj i ett rinnande kranvattenbad i 1-2 min. Lägg objektglasen i 95 % etanol med 0,5 % ättiksyra i 10 s.
    8. Färga objektglasen med eosin-Y i 30 s i rumstemperatur och överför sedan glasen till 100 % etanol i 5 min. Rensa proverna i ett d-limonenbaserat lösningsmedel i 5 minuter.
    9. Montera täckglasen med ett xylenbaserat monteringsmedium medan objektglaset fortfarande är vått med det d-limonenbaserade lösningsmedlet. Låt monteringsmediet stelna över natten.
      OBS: Använd inte ett vattenbaserat monteringsmedium.
  3. Förbered vävnader utan grovt synliga tumörer för att identifiera plexiforma neurofibrom och mikro-MPNST. Bädda in vävnaderna i paraffin, förbered histologiska sektioner och färga dessa sektioner med hematoxylin och eosin.
    1. Ta bort de inre organen och bädda in representativa delar av varje organ i paraffin för att förbereda H&E-färgade sektioner som kommer att undersökas för mikroskopiska tecken på tumörer (Figur 1B). Ta bort huvudet, frambenen, bakbenen och svansen (Figur 1C). För att undersöka ryggmärgen och nervrötterna in situ för tecken på nervrotstumörer, avkalka ryggraden och tillhörande revben och mjukvävnad genom nedsänkning i 0,3 M EDTA/4 % paraformaldehy (pH 8,0) i 48-72 timmar vid 4 oC; skölj sedan samples med 1x PBS. I slutet av avkalkningen, se till att avkalkningen är klar genom att försöka genomborra ryggraden med en nål. Avkalkningen lyckas om nålen lätt tränger in i benet utan att det knakar.
    2. Skär den avkalkade ryggraden och tillhörande strukturer i block som passar i en vävnadskassett. Dehydratisera genom graderade etanoler följt av ett d-limonenbaserat lösningsmedel enligt beskrivningen i punkterna 2.1.2–2.1.7. Bädda in i paraffin och förbered 4–5 μm sektioner enligt beskrivningen i punkterna 2.1.7–2.2.1. Utför H&E-fläckar enligt beskrivningen i steg 2.2.2-2.2.9; Låt monteringsmediet stelna över natten.

3. Identifiera potentiella plexiforma neurofibrom och utför speciella fläckar för att bekräfta diagnoser

OBS: Vi rekommenderar starkt att du inkluderar en erfaren human- eller veterinärpatolog i utvärderingen av H&E och speciella fläckar av GEM-tumörsnitt.

  1. Undersök de H&E-färgade objektglasen som preparerats enligt beskrivningen ovan med hjälp av ljusfältsmikroskopi för att identifiera potentiella tumörer i perifera nervskidor. Eftersom neurofibrom och MPNST uppstår i perifera nerver är det viktigt att avgöra om mikroskopiska tumörer är associerade med en perifer nerv. Identifiera blockeringar med potentiella perifera nervskidas tumörer så att immunfläckar och andra speciella fläckar kan utföras för att bekräfta eller motbevisa diagnoser.
  2. Särskilja potentiella PN från MPNST/andra höggradiga neoplasmer baserat på histologiska egenskaper som ses vid ljusfältsundersökning av H&E-färgade snitt. Humana PN är lätt hypercellulära tumörer som huvudsakligen består av celler med långsträckta, ofta vågiga kärnor. I många områden är cellerna löst packade och kan separeras av myxoid extracellulärt material; PN i P 0-GGFβ3-möss har ett liknande utseende. Mitos är vanligtvis inte närvarande; om de är det och tumören är måttligt till mycket hypercellulär, är tumören en MPNST eller annan typ av höggradig neoplasm (se nedan).
  3. PN består av en blandning av neoplastiska Schwann-celler och andra icke-neoplastiska celltyper, t.ex. mastceller. För att bekräfta identiteten hos en PN, utför immunfärgning för Schwann-cellmarkörerna S100β och Sox10 och mastcellsmarkören CD117 (c-Kit) på sektioner från block som innehåller potentiella PN som identifierats vid H&E-undersökning (se avsnitt 3.4 för alternativa alternativ för mastcellsmarkörfärgning). Utför Ki67 immunfärgning för att bekräfta låga spridningshastigheter.
    OBS: Tabell 1 listar de antigenmarkörer som används för rutinmässig identifiering av GEM plexiforma neurofibrom (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnos av MPNST och för en fullständig bedömning av andra celltyper som förekommer i neurofibrom; vi färgar för dessa senare antigener först när vi först beskriver en ny GEM-modell. Se antikroppstillverkarens datablad för rekommenderade förhållanden. Notera om antikroppstillverkarens bipacksedel rekommenderar antigenhämtning. Det är inte alla antigener som kräver hämtning för att kunna upptäckas.
    1. Förbered 4-5 μm sektioner från de valda paraffinblocken och montera dem på positivt laddade objektglas. Avparaffinisera avsnitt enligt beskrivningen i steg 2.2.2-2.2.6.
    2. Skölj sektionerna med 1x PBS i 3-5 min.
    3. Om antikroppstillverkaren rekommenderar antigenhämtning, förbered citratbuffert. Blanda 9 ml citronsyralösning (10,5 g citronsyra i 500 ml destillerat vatten) och 41 ml natriumcitratlösning (14,7 g natriumcitrat i 500 ml destillerat vatten).
    4. Utför antigenhämtning genom att placera objektglas i citratbuffert i 20 minuter i en uppvärmd riskokare.
    5. Överför objektglasen till 3 % väteperoxid/1x PBS i 10 minuter för att eliminera peroxidasaktivitet i vävnaden.
      OBS: Gör denna lösning fräsch varje gång och använd inte stamlösningen av väteperoxid om den är äldre än 3-4 månader.
    6. Skölj sektionerna i 1x PBS.
    7. Blockera sektioner med blockeringsbuffert (2 % BSA, 0,1 % Triton X-100 i 1x PBS) i 1 timme. Skölj objektglasen kort i 1x PBS.
    8. Tillsätt primär antikropp till vävnadssnitt. Bered primära antikroppar i utspädd blockerande buffert. Inkubera objektglasen i 2 timmar vid 37 °C eller över natten vid 4 °C.
    9. Tvätta objektglasen i 1x PBS i 5 min. Upprepa 3x.
    10. Inkubera vävnad med biotinylerad sekundär antikropp i 1-2 timmar.
    11. Bered diaminobenzidin (DAB) lösning baserat på tillverkarens protokoll och sänk ner objektglasen i lösningen i 2-10 minuter. Tvätta objektglasen i vatten i 5 min.
    12. Motfärga sektioner genom att doppa dem i hematoxylin i 10-15 min. Utsätt för rinnande vatten tills det blir klart. Doppa snabbt objektglasen i alkohol och skölj objektglasen i vatten.
    13. Dehydratisera objektglas i graderade etanoler genom att snabbt doppa objektglas, 4-5 gånger per lösning, i 70 % etanol, 95 % etanol och sedan 100 % etanol. Inkubera objektglasen i ett d-limonenbaserat lösningsmedel i 2 min. Inkubera objektglasen i en andra sats d-limonenbaserat lösningsmedel i 2 minuter.
    14. Montera objektglasen med ett xylenbaserat monteringsmedium.
    15. Undersök objektglas med ljusfältsmikroskopi.
    16. För immunofluorescens, utelämna steg 3.3.10-3.3.15. Inkubera istället vävnad med artspecifik sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert i 1-2 timmar.
    17. Skölj objektglasen i 1x PBS i 5 min. Upprepa 3x.
    18. Montera objektglas med 1x PBS/glycerol.
    19. Undersök objektglas med fluorescensmikroskopi.
  4. Alternativ metod för färgning av mastceller: toluidinblå färgning
    1. Bered stamlösning av toluidinblått genom att lösa 1 g toluidinblått O i 100 ml 70 % etanol.
    2. Bered 1% natriumkloridlösning (NaCl) genom att lösa upp 0,5 g NaCl i 50 ml destillerat vatten. Blanda för att lösa upp. Justera pH till cirka 2.0-2.5 med HCl.
      OBS: Denna NaCl-lösning måste göras fräsch varje gång fläckar utförs.
    3. Bered arbetslösningen toluidinblått genom att tillsätta 5 ml stamlösning av toluidinblått till 45 ml av 1 % NaCl-lösningen. Blanda väl och se till att pH-värdet är cirka 2,3.
      OBS: Ett pH högre än 2.5 kommer att resultera i färgning med mindre metakromasi. Gör denna lösning fräsch varje gång färgning utförs.
    4. Avparaffinisera 4–5 μm sektioner monterade på positivt laddade objektglas enligt beskrivningen i punkterna 2.2.2–2.2.6. Tvätta avparaffiniserade sektioner i rinnande vatten i 2 min.
    5. Fläcksektioner i toluidinblå arbetslösning i 2-3 min. Tvätta i destillerat vatten i 2 min.
    6. Torka sektioner genom att doppa 10 gånger i 95 % etanol. Doppa slides i 100% etanol 10x. Doppa slides i färsk 100 % etanol 10 gånger till.
    7. Inkubera objektglasen i ett d-limonenbaserat lösningsmedel i 2 min. Inkubera objektglasen i en andra sats d-limonenbaserat lösningsmedel i 2 minuter.
    8. Montera täckglas med ett xylenbaserat monteringsmedium medan objektglaset fortfarande är vått med ett d-limonenbaserat lösningsmedel.
      OBS: Använd inte ett vattenbaserat monteringsmedium.
    9. Undersök objektglas med ljusfältsmikroskopi. Identifiera mastceller genom närvaron av mörklila granuler i deras cytoplasma. Övriga celltyper är färgade ljusblå.

4. Speciella fläckar för att diagnostisera MPNST och utesluta alternativa diagnoser

  1. Det histologiska utseendet hos humana MPNST är mycket varierande och flera olika tumörtyper har ett utseende som liknar det hos MPNST28. Eftersom MPNST härstammar från Schwann-cellinjen, bestäm om tumören härrör från en perifer nerv eller inom en befintlig godartad PN genom grov undersökning eller ljusfältsmikroskopisk undersökning av H&E-färgade snitt. Även om MPNST ibland inte är i samband med en perifer nerv eller PN (vanligtvis på grund av oavsiktlig separation från nerven under dissektion, förstörelse av den redan existerande PN via MPNST-överväxt eller för att lesionen är metastaserande), leta efter associationen mellan tumören och en nerv eller PN eftersom diagnosen är mindre sannolik om tumören inte är associerad med en nerv eller PN.
  2. Bered 4-5 μm sektioner av paraffinblock som innehåller potentiella MPNST och montera dem på positivt laddade objektglas enligt beskrivningen i steg 2.2.1. Avparaffinisera avsnitt enligt beskrivningen i steg 2.2.2-2.2.6.
  3. Utför immunhistokemi med den panel av antikroppar som anges i tabell 2 enligt beskrivningen i steg 3.3.1–3.3.15.
  4. Undersök immunfärgningarna med ljusfältsmikroskopi. Eftersom MPNST uppvisar schwannisk differentiering, leta efter enhetlig eller fläckvis immunreaktivitet för S100β, nestin och Sox10. Om tumörerna inte är positiva för dessa tre markörer, se tabell 2 för att fastställa diagnosen.
    OBS: MPNST för människor och möss kan uppvisa divergerande differentiering. Till exempel uppvisar vissa humana MPNST fokal rabdomyoblastisk differentiering (dessa varianter är kända som maligna Triton-tumörer); även om dessa neoplasmer kommer att färga för Schwannian-markörerna, uttrycker de också muskelmarkörer som desmin, MyoD1 och myogenin. Immunreaktivitet för dessa senare markörer bör inte avskräcka forskare från att diagnostisera tumören som en MPNST. Även om flera musmodeller som villkorligt uttrycker SS18-SSX-fusionsgenen har etablerats för att modellera synovialt sarkompatogenes29, är synoviala sarkommodeller som spontant genererar motsvarande fusionstranskript inte kända. Följaktligen letar vi inte efter SS18-SSX-fusionstranskript i GEM-tumörer och förlitar oss istället på immunhistokemiska profiler.

5. Gradering av MPNST

  1. Bestäm om tumörnekros, ett kännetecken för WHO grad IV MPNST, är närvarande. För MPNST av grad IV, leta efter framträdande hypercellularitet, snabb mitotisk aktivitet (≥4 mitoser per 10 högeffektsfält (40x) och cytologisk atypi.
    1. Om nekros inte föreligger, bedöm tumören för att avgöra om hypercellularitet, snabb mitotisk aktivitet och cytologisk atypi är närvarande. Om alla dessa egenskaper är närvarande i frånvaro av nekros, klassificera tumören som en WHO grad III MPNST.
    2. WHO-tumörer av grad II kännetecknas av cellularitet som är förhöjd, men i mindre grad än WHO-tumörer av grad III och IV. Tumörcellkärnorna i en WHO grad II MPNST uppvisar ökad storlek (mer än 3 gånger så stor som tumörcellkärnorna i neurofibrom) och hyperkromasi. Ökad mitotisk aktivitet (<4 mitoser per 10 högeffektfält) är associerad med, men inte ett krav för, WHO-tumörer av grad II.
      OBS: Eftersom tumörer av högre grad vanligtvis utvecklas från lägre grader, kan låggradiga och höggradiga regioner finnas i samma MPNST. Under dessa omständigheter bestäms tumörens grad av den högsta gradiga regionen som finns.
      OBS: Det finns kontroverser bland mänskliga patologer om huruvida WHO:s graderingssystem som beskrivs ovan är prediktivt för patientresultat och vissa av dessa patologer föredrar istället att helt enkelt klassificera MPNST som låggradig eller höggradig. Enligt detta schema har höggradiga MPNST framträdande cytologisk atypi, snabb mitotisk aktivitet (>5 mitoser per 10 högeffektfält) och markerad hypercellularitet med eller utan nekros. Låggradig MPNST saknar nekros men uppvisar mitotisk aktivitet, cytologisk atypi och cellularitet som ligger mellan en höggradig MPNST och en atypisk neurofibromatös tumör med okänd biologisk potential (ANNUBP). Vi föredrar det system som beskrivs ovan eftersom det kan vara svårt att skilja mellan en ANNUBP och en låggradig MPNST för utredare som inte har lång erfarenhet av dessa enheter.

6. Beredning av kulturer av tidig passage P 0-GGFβ3 MPNST-celler

  1. Odla tidiga passage-P 0-GGFβ3-tumörceller från färsk tumörbit 2 (steg 1.5, figur 1A). Upprätthåll sterila förhållanden från och med nu.
    1. Dissociera tumören genom att skära den i små (2-4 mm) bitar och hacka i DMEM10 (Dulbeccos minimala essentiella medium) innehållande 10% fetalt kalvserum, 2 μmol/L forskolin och 10 nmol/L neuregulin 1β (NRG1β) i 100 mm vävnadsodlingsskålar.
    2. Låt cellerna växa ut från de malda vävnadsfragmenten vid 37 °C i 5 % CO2 tills plattorna är sammanflytande. Byt media var 3-4:e dag.
    3. Dela cellkulturen. Ta bort mediet från 100 mm skålen och tvätta cellerna med PBS; Ta bort och kassera malet papper. Ta bort PBS och tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin i 2-5 minuter vid rumstemperatur. För att främja cellavlossning, knacka försiktigt på plattan och kontrollera om den lossnar med ett ljusmikroskop; Förläng trypsininkubationen vid behov.
    4. Neutralisera trypsin genom att tillsätta 2 ml DMEM10. Överför cellsuspensionen till ett centrifugrör och pelletsceller med en temperatur på 500 × g i 5 minuter. Ta bort mediet och tillsätt 5 ml färsk DMEM10 till pelleten.
    5. Fördela cellsuspensionen i två till fyra 100 mm skålar innehållande DMEM10. Dela inte cellerna för mer än fem passager (steg 6.1.3 och 6.1.4) och behåll dem i DMEM utan forskolin och NRG1β. Kom ihåg att frysa ner cellerna vid passage 2 för framtida bruk.

7. Verifiering av identiteten hos MPNST-celler med hjälp av immunocytokemi

  1. Placera sterila 18 mm #1.5 runda glastäcken i brunnarna på sterila vävnadsodlingsskålar med 6 brunnar.
    1. Placera poly-L-lysin/lamininlösning i brunnarna i en volym som är tillräcklig för att täcka täckglaset. Försegla plattan med plastfolie för att minimera avdunstning. Inkubera vid 4 °C över natten. Nästa morgon tvättar du täckglasen 3 gånger med steril PBS.
      OBS: Vi har försökt att plätera MPNST-celler med tidig passage på obelagda täckglas och har funnit att cellerna inte fäster bra i frånvaro av poly-L-lysin/lamininbeläggning.
    2. Platta 10 000 celler på täckglaset genom att försiktigt tillsätta 2 ml av cellsuspensionen i odlingsmedia i varje brunn som innehåller täckglaset. Inkubera plattorna över natten vid 37 °C med 5 % CO2 i en vävnadsodlingsinkubator.
    3. Nästa morgon, skölj täckglasen i 2 x 5 minuter med PBS.
    4. Fixera celler med 4% paraformaldehyd i PBS i 18 min vid rumstemperatur.
    5. Skölj täckglasen 3 x 5 min med PBS. Om så önskas, försegla plattan med plastfilm och förvara den vid 4 °C vid denna tidpunkt.
    6. Gör färsk 50 mM NH4Cl i PBS. Släck aldehyder genom att inkubera täckglas i 50 mM NH4Cl i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur.
    7. Permeabilisera cellerna genom att inkubera täckglas i 0,3 % Triton X-100 i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta täckglas i 3 x 5 min med PBS.
    8. Blockera icke-specifik bindning genom att inkubera täckglas i blockerande buffert (1x PBS innehållande 1 % bovint serumalbumin, 0,2 % fettfri torrmjölk och 0,3 % Triton X-100) i 1 timme vid rumstemperatur.
    9. Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt primära antikroppar som känner igen MPNST-markörerna som finns i modertumören (vanligtvis S100β, Nestin och Sox10) utspädda till den förutbestämda optimala utspädningen i blockeringsbufferten. Linda in plattan med plastfilm och inkubera vid 4 °C över natten i en fuktad kammare.
    10. Tvätta 3 x 5 min med PBS för att avlägsna obundna primära antikroppar. Tillsätt sekundär antikropp med fluorescerande etikett utspädd i blockerande buffert och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Skydda mot ljus.
    11. Tvätta 3 x 5 min med PBS. Inkubera täckglasen i 1-5 μg Hoechst-färg i 10 min. Fortsätt att skydda mot ljus.
    12. Tvätta täckglas med PBS i 5 min. Montera objektglasen med 1:1 1x PBS/glycerol. Bild med fluorescerande mikroskop.

8. Allograft av tumörceller med tidig passage för att påvisa tumörigenicitet

  1. Odla tidiga passage-P 0-GGFβ3 MPNST-celler i DMEM10 till 80 % sammanflöde. Skölj cellerna en gång med rumstemperatur Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Behandla cellerna i 30 s till 1 minut med en icke-enzymatisk celldissociationslösning för att avlägsna dem från substratet. Tillsätt 5 ml DMEM10 per 1 ml av ett icke-enzymatiskt celldissociationsreagens.
    OBS: Cellulär dissociation kan ta mycket längre tid, upp till 10-20 min. Se tillverkarens protokoll.
    OBS: Odla inte celler till sammanflöde eftersom detta kommer att minska transplantatets effektivitet.
    1. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Spinn cellerna nedåt vid 5 × g i 5 minuter och återsuspendera dem i en koncentration av 1-2 × 106 celler per 100 μl DMEM10. Håll cellerna på is tills de är redo för injektion.
    2. Bedöva NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) möss i induktionskammaren i en isofluranförångare. Lägg djuret på magen och sterilisera injektionsstället med 70 % etanol. Låt injektionsstället lufttorka före injektionen. Låt cellerna få rumstemperatur före injektionen.
    3. Injicera 1-2 x 106 celler subkutant i höger flank. Placera musen ensam i en sängfri bur och låt den återhämta sig. Se till att endast en del av buren är på en värmedyna för att förhindra hypotermi. Detta ger en zon som musen kan flytta till om den blir överhettad.
      OBS: Vi ympar minst tre möss med varje tidig passagekultur eftersom vissa transplantat kanske inte tar.
    4. Låt transplantatet växa i 15-60 dagar; Bedöm djurens hälsa 3 gånger i veckan och registrera kroppskonditionspoäng, inklusive vikt och beteendeförändringar vid varje undersökning. Avsluta möss som har nått högsta tillåtna transplantatstorlek eller döende möss med hjälp av koldioxideutanasi följt av cervikal dislokation. Rekordålder vid dödsfall i dagar. När tumörer blir synliga utåt, registrera tumörens dimensioner (längd, bredd och höjd).
      OBS: Enligt vår erfarenhet ympar olika MPNST-kulturer med tidig passage med varierande effektivitet och skiljer sig åt i den tid som krävs för transplantattillväxt. Djuren får inte tillåtas att överskrida den högsta tillåtna tumörstorleken och/eller det humana effektmåttet som godkänts av IACUC.
  2. Skörda tumören, fixera den i 4 % paraformaldehyd, bädda in den i paraffin och utför H&E-färgning enligt beskrivningen i avsnitt 2.1-2.2.9 för att verifiera att allograftet är en tumör snarare än en reaktiv vävnad. Vid behov immunfärgas transplantatet för de markörer som fanns i modertumören.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerar exempel på grovt uppenbara tumörer som uppstår i P 0-GGFβ3-möss. Tumörer som är lätta att identifiera med blotta ögat kan ses som massor som utvidgar kroppsregioner som visas i figur 2A (pil). När man avgör om tumören potentiellt är en tumör i perifer nervskida är det viktigt att fastställa att tumören är associerad med en perifer nerv. I detta fall visar en MRT-skanning (Figur 2B) att tumören är associerad med ischiasnerven (pilspetsen); Detta samband bekräftades efter avlivning av musen och dissekering av tumören. Det bör noteras att en stor storlek inte nödvändigtvis indikerar att tumören är malign. I detta fall visade en histologisk undersökning av tumören (Figur 2C) att det rörde sig om ett neurofibrom. Vanligast är dock att grovt uppenbara tumörer inte identifieras förrän man utför obduktionen av musen. Figur 2D illustrerar en stor, köttig MPNST som uppstod i plexus brachialis på detta djur.

Figur 3 illustrerar representativa exempel på MPNST och neurofibrom från P 0-GGFβ3-möss preparerade enligt de procedurer som beskrivs i avsnitt 1 i protokollet. Figur 3A-J illustrerar tio exempel på oberoende MPNST från vår P0-GGFβ3-muskoloni. Observera att det histologiska utseendet hos MPNST kan vara mycket varierande, även mellan MPNST som uppstår oberoende av varandra hos samma djur. Denna histologiska variabilitet illustrerar varför vi rutinmässigt bekräftar diagnosen P 0-GGFβ3 MPNST med immunhistokemiska fläckar. Vi vill också påpeka att andra, till synes obesläktade tumörtyper förekommer sporadiskt med låg frekvens i vissa inavlade musstammar (t.ex. har vi flera gånger stött på lymfom hos P 0-GGFβ3-möss som bär transgenen på en C57BL/6J-bakgrund), vilket ytterligare betonar vikten av att använda immunhistokemi för att bekräfta tumördiagnoser. Trots variationen i deras histologiska utseende var alla tio tumörer som illustreras i figur 3A-J immunreaktiva för S100β och nestin och negativa för markörer för andra tumörtyper. Figur 3K illustrerar en representativ bild av en korrekt avkalkad ryggrad och tillhörande vävnader. Observera att ryggmärgen, nervrötterna, ryggraden och skelettmuskulaturen alla upprätthåller sitt korrekta anatomiska förhållande till varandra. Figur 3L är en bild av ryggraden och den överliggande ryggmärgen. Eftersom denna vävnad är ordentligt avkalkad har benet skurit lätt utan att strimlas eller vikas, och benmärgen är lätt identifierbar i märgutrymmena. Om vävnaden inte hade avkalkats ordentligt skulle den ha fastnat på mikrotombladet och slitits ut ur sektionen, vilket hade orsakat betydande skador på intilliggande vävnader (ryggmärg, spinalnervrötter och skelettmuskulatur. Figur 3M visar en representativ bild av ett neurofibrom som uppstår i en dorsalnervrot i en P 0-GGFβ3-mus. Observera att denna tumör är mindre cellulär än MPNST:erna som visas i figur 3A-J. Den viktigaste diagnostiken för neurofibrom är att de består av en komplex blandning av neoplastiska Schwann-celler och icke-neoplastiska mastceller, makrofager, fibroblaster och perineurialliknande element som infiltrerar nerven och sprider axoner isär.

Figur 4 illustrerar exempel på de färgämnen som är mest användbara för den första identifieringen av ett plexiformt neurofibrom och för att skilja mellan ett plexiformt neurofibrom och ett MPNST. Figur 4A illustrerar S100β immunreaktivitet i ett P 0-GGFβ3 plexiform neurofibrom. Observera att S100β immunreaktivitet endast är uppenbar i en subpopulation av celler, vilket är i linje med det faktum att neurofibrom består av en blandning av neoplastiska Schwann-celler och andra icke-neoplastiska element (fibroblaster, mastceller, makrofager, perineurialliknande celler, en dåligt definierad CD34-immunreaktiv cellulär population och vaskulatur). Tyvärr skiljer inte fläckvis S100β-färgning mellan plexiforma neurofibrom och MPNST, eftersom S100β-färgning kan vara fläckvis i MPNST (H&E-färgning är dock användbar för detta ändamål, eftersom MPNST vanligtvis är mer cellulära än plexiforma neurofibrom [se figur 3]). Neoplastiska Schwann-celler är också immunreaktiva för det intermediära filamentet nestin, vilket visas i P 0-GGFβ3 MPNST som presenteras i figur 4B. Neoplastiska Schwann-celler uppvisar också ofta nukleär immunreaktivitet för transkriptionsfaktorn Sox10, vilket visas i en MPNST i figur 4C. Egenskaper som är användbara för att skilja mellan plexiforma neurofibrom och MPNST är närvaron av mastceller och framträdande immunreaktivitet för Ki67-proliferationsmarkören. Figur 4D illustrerar en Unna-färgning utförd på ett P 0-GGFβ3 plexiformt neurofibrom för att markera närvaron av mastceller, som lätt kan identifieras genom den framträdande metakromatiska violetta färgningen av deras cytoplasmatiska granuler. Mastceller finns inte i MPNST. Däremot är Ki67-immunreaktivitet praktiskt taget obefintlig i plexiforma neurofibrom, vilket ses i P 0-GGFβ3-tumören som visas i figur 4E. Kärn-Ki67-märkning finns vanligtvis i en mycket hög fraktion av tumörceller, vilket ses i den mikroskopiska MPNST som uppstår i trigeminusgangliet hos en P 0-GGFβ3-mus (figur 4F).

Figur 5 illustrerar exempel på de infärgningar som vi utför för att fullt ut karakterisera den cellulära sammansättningen av neurofibrom i en nyutvecklad GEM-modell. Även om de fläckar som visas i denna figur erhölls i humant dermalt neurofibrom, är de identiska till utseendet med vad vi har sett i GEM-tumörer. Immunreaktivitet för CD117 (c-Kit) finns i mastceller inom neurofibrom och har därför en fördelning som är mycket lik den som ses med Unna-fläckar (se figur 3A). Makrofager finns också utspridda i neurofibrom, vilket ses med pan-makrofagmarkören Iba1 (se figur 5D); Detta inkluderar underklasser av makrofager som är immunreaktiva för CD163 och CD86 (se figur 5B respektive figur 5C). En bråkdel av det Schwannska elementet i neurofibrom visar också nukleär immunreaktivitet för Sox10. Fibroblaster kan belysas av deras immunreaktivitet för TCF4. I figur 5G betecknar CD31 de vaskulära elementen i neurofibromet, medan CD34, som visas i figur 5H, betecknar en gåtfull dendritisk population av celler som har föreslagits vara antingen en subpopulation av inhemska vävnadsmakrofager30 eller en ny population av nervskieceller som varken är Schwann-celler eller fibroblaster31.

Figur 6 ingår för att möjliggöra jämförelse av humana plexiforma neurofibrom och MPNST med de tumörer som ses i P 0-GGFβ3-möss och för att ge representativa exempel på några av de humana tumörtyper som kan förväxlas med MPNST. Figur 6A illustrerar ett plexiformat neurofibrom som uppstod i plexus brachialisis hos en NF1-patient, medan figur 6B visar WHO-grad IV MPNST som uppstod inom samma plexiforma neurofibrom. Figur 6B visar några av de karakteristiska egenskaperna hos en MPNST av WHO-grad IV, inklusive markerad hypercellularitet och cellulär atypi, snabb mitotisk aktivitet och tumörnekros. Som jämförelse visar figur 6C en WHO grad II MPNST som har betydande cellulär atypi men är mindre hypercellulär än grad IV MPNST och, även om mitoser är närvarande, visar mindre mitotisk aktivitet. Figur 6D illustrerar ett fibrosarkom med sitt karakteristiska "fiskbensmönster" av sammanvävda höljen av tumörceller. Detta mönster skiljer dock inte nödvändigtvis mellan fibrosarkom och MPNST, eftersom vissa MPNST kommer att ha ett liknande mönster. Vidare visar den högre effektbilden som presenteras i figur 6E cellulär morfologi som liknar den som ses i WHO:s grad IV MPNST som presenteras i figur 6B. Figur 6F illustrerar ett leiomyosarkom. Till skillnad från de flesta MPNST är leiomyosarkom immunreaktiva för muskelmarkörer som glatt muskelaktin och desmin. Immunreaktivitet mot aktin i glatt muskulatur kan dock variera från tumör till tumör, där vissa tumörer uppvisar intensiv enhetlig immunreaktivitet (Figur 6G) och andra visar immunreaktivitet som visar cellulär variabilitet inom tumören (Figur 6H). Desmins immunreaktivitet kan också vara fläckvis vid leiomyosarkom (Figur 6I). Melanom är mycket varierande i morfologi, där vissa tumörer består av polygonala celler (Figur 6J) och andra består av spindlade celler som kan efterlikna morfologin hos MPNST-celler. Melanom kan särskiljas från MPNST genom immunreaktivitet för melanosommarkörer såsom MART1 (Figur 6K). Melanom, liksom MPNST, är dock ofta positiva för S100β och Sox10 (Figur 6L).

Figur 7 illustrerar de patologiska egenskaperna hos MPNST av WHO-grad II, III och IV isolerade från P0-GGFβ3-möss. Figur 8 visar representativa bilder av tidiga passager av P 0-GGFβ3 MPNST-celler vid låg (figur 7A) och hög (figur 7B) effekt. Tumörigeniciteten hos dessa celler visas både genom deras förmåga att bilda kolonier när de suspenderas i mjuk agar (Figur 7C) och att bilda transplantat när de allotransplanteras subkutant i möss med immunbrist (Figur 7D).

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde som används för att bearbeta tumörvävnad och annan vävnad från P 0-GGFβ3-möss. (A) Grovt synliga tumörer skördas och segmenteras i tre delar för 1) fixering i 4 % paraformaldehyd följt av immunhistokemi och histokemi, 2) etablering av tidig passage tumörcellodling och/eller genomiska analyser, och 3) snabbfrysning med flytande kväve för protein-, DNA- eller RNA-isolering. (B) Efter excision av tumören fixeras musens kropp i 4% paraformaldehyd och de inre organen avlägsnas. Dessa organ provtas för histologisk undersökning som utförs för att identifiera mikroskopiska tecken på neoplasm och andra patologiska processer. C) När de inre organen avlägsnats avlägsnas extremiteterna (huvud, extremiteter, svans) och skinn från slaktkroppen. Kotpelaren, intilliggande revben och intilliggande skelettmuskulatur avkalkas med 0,3 M EDTA/4 % paraformaldehyd (pH 8,0). De avkalkade vävnaderna paraffinbäddas sedan och delar av vävnaderna förbereds för immunhistokemisk och histokemisk undersökning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av grovt uppenbara neurofibrom och MPNST hos P 0-GGFβ3-möss. (A) P 0-GGFβ3 mus med en stor grovt tydlig tumör på höger flank (pil). (B) En MRT-undersökning av denna mus visar att tumören är ansluten till ischiasnerven (pilspetsen) och att den har vuxit genom den överliggande fascian för att expandera inom den subkutana (pil, tumörmassa). (C) Mikroskopisk undersökning av denna tumör visar att tumören, trots sin stora storlek, är ett neurofibrom. (D) Stor köttig MPNST som uppstod i plexus brachialis på en P 0-GGFβ3-mus. Skalstapel = 100 μm. (C). Förkortningar: MPNST = maligna perifera nervskidetumörer; MRT = magnetisk resonanstomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av MPNST, avkalkad kotpelare och neurofibrom preparerade enligt beskrivningen i protokollavsnitt 1. (A-J) Exciderade och H&E-färgade P 0-GGFβ3 MPNST uppvisar histologisk variabilitet. Alla avbildningar är oberoende av varandra. Trots denna histologiska variabilitet uppvisade alla dessa tumörer lämplig märkning för de MPNST-markörer som anges i tabell 1. Skalstreck = 200 μm. (K) Representativ bild av ett H&E-färgat tvärsnitt av den avkalkade ryggraden. I den här bilden är följande strukturer lätta att visualisera: ryggmärgen; ryggradsben; dorsalrotsganglierna på ryggmärgsnervroten; och paravertebral skelettmuskulatur. Förstoring 4x. (L) En högeffektsbild av ryggmärgen och kotan som visas i K visar benets korrekta utseende efter avkalkning med denna metod. Förstoring 10x. (M) Representativ bild av ett neurofibrom vid dorsalnervroten i en P 0-GGFβ3-mus. Förstoring 40x. Skalstreck = 100 μm. Förkortningar: MPNST = maligna perifera nervskidetumörer; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Diagnostisk färgning som används för den första identifieringen av plexiforma neurofibrom och deras distinktion från MPNST. (A) Immunfärgning för S100β i ett P 0-GGFβ3 plexiformt neurofibrom. Observera att intensiv brunfärgning för detta antigen endast finns i en delmängd av cellerna i denna tumör, vilket överensstämmer med det faktum att neurofibrom består av neoplastiska Schwann-celler och flera andra icke-neoplastiska celltyper. (B) Immunofluorescensbild av en P 0-GGFβ3 MPNST färgad för det intermediära filamentet nestin (röd) och motfärgad med bisbenzimid (blå, nukleär färg). (C) MPNST färgat för transkriptionsfaktorn Sox10. Intensiv immunreaktivitet (brun) är uppenbar i kärnorna i en undergrupp av tumörceller. (D) Högeffektsvy av ett P 0-GGFβ3 plexiformt neurofibrom efter en Unna-fläck. Denna färgning ger metakromatisk (violett) färgning av granulerna i mastcellerna. Plexiforma neurofibrom kan särskiljas från MPNST eftersom de senare saknar mastceller. (E,F) Ki67 immunhistokemi i (E) a P 0-GGFβ3 plexiform neurofibrom och (F) a P0-GGFβ3 MPNST. Båda sektionerna har motfärgats med hematoxylin (blå kärnfärgning), där Ki67 immunreaktivitet är tydlig som brun kärnfärgning i dessa immunperoxidasfärgningar. Observera att ingen brun kärnfärgning är uppenbar i plexiform neurofibrom, medan de flesta tumörcellkärnor är positiva i MPNST. Skalstreck = 100 μm. Förkortning: MPNST = malign perifer nervskidetumör. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa bilder av immunfläckar som används för att identifiera de subpopulationer av celler som utgör neurofibrom. Dessa immunofluorescerande bilder från ett humant dermalt neurofibrom har färgats för (A) CD117 (c-Kit; en markör för mastceller), (B) CD163 (M2-makrofager), (C) CD86 (M1-makrofager), (D) Iba1 (pan-makrofagmarkör), (E) Sox10 (Schwann-cellmarkör), (F) TCF4 (fibroblastmarkör), (G) CD31 (markör för kärl) och (H) CD34 (markerar en distinkt, dåligt förstådd subpopulation av celler i neurofibrom). Förstoring 60x, skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Representativa bilder av plexiforma neurofibrom, MPNST och några andra humana tumörtyper som beaktas vid differentialdiagnosen av en MPNST. (A) Plexiform neurofibrom som uppstår i plexus brachialisen hos en NF1-patient, som visar den övergripande lägre cellulariteten och det godartade utseendet hos denna neoplasm. Även om det inte är lätt att visualisera i H&E-färgade sektioner, finns det en komplex blandning av celltyper. Mitos ses inte. Förstoring: 40x. (B) En WHO grad IV MPNST som uppstod från det plexiforma neurofibromet som illustreras i A. Notera den mycket högre graden av cellularitet. Pilen indikerar en mitotisk figur, och asterisken betecknar ett område med tumörnekros i den övre högra delen av detta mikroskopiska fält. Förstoring: 40x. (C) En WHO grad II MPNST. Denna tumör har en lägre grad av cellularitet än WHO:s grad IV MPNST som illustreras i B. Det finns dock mer nukleär atypi och hyperkromasi än vad som är uppenbart i det plexiforma neurofibromet som illustreras i A. Pilen indikerar en av de enstaka mitotiska figurerna som påträffades i denna neoplasm. Förstoring: 63x. (D) En lågeffektsbild av ett fibrosarkom av vuxentyp som illustrerar "fiskbensmönstret" (de sammanvävda höljena av tumörceller) som vanligtvis ses i denna tumörtyp. Dessvärre förekommer fiskbensarkitektur även hos vissa mänskliga MPNST och kan därför inte användas för att skilja mellan fibrosarkom och MPNST. Förstoring: 20x. (E) En högre effektvy av fibrosarkom illustrerad i D. Notera likheten mellan den cellulära morfologin i detta fibrosarkom och den cellulära morfologin som är uppenbar i WHO:s grad IV MPNST som visas i B. Förstoring: 40x. (F) Kraftfull bild av ett leiomyosarkom, som visar cellulär morfologi som faller inom variationsområdet som ses i MPNST. Förstoring: 40x. (G) Immunfärgning för glatt muskelaktin i leiomyosarkom illustrerat i F. Observera att tumörcellerna uppvisar enhetlig intensiv immunreaktivitet för detta antigen. Förstoring: 40x. (H) Immunfärgning för glatt muskelaktin vid ett annat leiomyosarkom. I denna tumör finns det större variation i graden av immunreaktivitet, där vissa celler färgas mer intensivt än andra. Det är inte ovanligt att immunreaktivitet för samma antigen är jämnt närvarande i en tumör och endast finns i en undergrupp av tumörceller i en annan tumör. Förstoring: 40x. (I) Immunfärgning för desmin i ett tredje leiomyosarkom. I denna tumör är endast en delmängd av tumörcellerna intensivt immunreaktiva för detta antigen. (J) Metastaserande melanom. Melanom är ökända för att ha mycket varierande morfologi som kan variera från kuboidal till spindelformad; tumörer med den senare morfologin kommer sannolikt att förväxlas med MPNST, särskilt med tanke på att både melanom och MPNST kan uppvisa S100β och Sox10 immunreaktivitet. Förstoring: 40x. (K) Immunreaktivitet för melanommarkören MART1 i tumören illustrerad i J. Förstoring: 40x. (L) Nukleär immunreaktivitet för transkriptionsfaktorn Sox10 i melanomet som visas i J. Förstoring: 40x, skalstreck = 100 μm. Förkortning: MPNST = malign perifer nervskidetumör. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Representativa bilder av WHO grad II-IV P 0-GGFβ3 MPNST. (A) Mikrofotografier med låg effekt och (B) mikrofotografier med hög effekt av en MPNST av WHO-klass II. Observera att cellulariteten är lägre än WHO:s grad III MPNST som illustreras i panel C och att kärnorna i tumörcellerna i D är mer hyperkromatiska (mörkare) än de som ses i panel B. (C) Låg- och (D) mikrofotografier med hög effekt av en MPNST av WHO-klass III. Denna tumör uppvisade >4 mitotiska siffror per 10 högeffektfält, med celler som var tätare packade och mer hyperkromatiska, atypiska kärnor. (E) Låg- och (F) högeffektsvyer av en MPNST av WHO-grad IV. Notera nekrosens fokus i den nedre mittdelen av panel F. Låg effekt = 20x. Hög effekt = 40x, skalstaplar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Representativa bilder av tidiga passage-P 0-GGFβ3 MPNST-celler och deras tumörigenicitet som påvisats genom tillväxt i mjuk agar och deras förmåga att växa som allotransplantat. (A) Låg- och (B) högeffekts faskontrastbilder av tidiga passage-P0-GGFβ3 MPNST-celler. C) P 0-GGFβ3 MPNST-celler som odlats i mjuk agar och färgats med sudansvart. Kolonierna syns som svart puncta i agar. (D) Hematoxylin och eosinfärgad bild av en tumör som bildades efter att P 0-GGFβ3 MPNST-celler allotransplanterades subkutant i en mus med immunbrist enligt beskrivningen i protokollet. (E) Proliferation av tidiga passage-P 0-GGFβ3 MPNST-celler under en 5-dagarsperiod bestämd med en Celigo Image Cytometer. Låg effekt = 10x, hög effekt = 40x; skalstapel = 100 μm för alla paneler Klicka här för att se en större version av denna figur.

Namn Användning Artens reaktivitet/klass
CD117 Utspädd kanin monoklonal
CD163 1:200 mus monoklonl
CD31 1:50 kanin polyklonal
CD34 1:2000 kanin monoklonal
CD86 1:1000 kanin monoklonal
Cytokeratin 1 μg/ml mus monoklonal
Desmin Desmin 1:50 mus monoklonal
Iba1 1:500 polyklonal kanin
Ki-67 1:50 kanin monoklonal
MART1 1 μg/ml mus monoklonal
Nestin 1:1,000 mus monoklonal
PMEL 1:100 Rabbot monoklonal
S100B 1:200 kanin polyklonal
SMA 1:100 mus monoklonal
Sox10 1:10 mus monoklonal
TCF4/TCFL2 1:100 kanin monoklonal

Tabell 1: Antikroppar som används för diagnos av plexiform neurofibrom och maligna tumörer i perifera nervskidor. Antikroppar som används för rutinmässig identifiering av GEM plexiforma neurofibrom (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnos av MPNST och en fullständig bedömning av andra celltyper som förekommer i neurofibrom. Förkortning: MPNST = malign perifer nervskidetumör.

S100β Nestin Sox10 MART1 PMEL Desmin Desmin Aktin för glatt muskulatur Cytokeratin SS18-SSX Fusion
MPNST 50-90%, vanligtvis fokal Positiva1 ~30 % Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
Fibrosarkom Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
Leiomyosarkom Sällsynt Negativ Negativ Negativ Negativ 50-100% Positiv ~40 % Negativ
Epiteloidsarkom Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Negativ
Melanom Positiv Positiv 85% Positiv Positiv Negativ Negativ Negativ Negativ
Monofasiskt synovialt sarkom ~30 % Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Positiv

Tabell 2: Markörer som används för att fastställa tumöridentitet hos människa. Dessa immunhistokemiska och histokemiska markörer, tillsammans med en bedömning av tumörmikroskopisk morfologi, används för att skilja MPNST från andra tumörer som efterliknar dem. Den differentialdiagnos som vanligtvis övervägs för humana MPNST inkluderar fibrosarkom av vuxentyp, epiteloidsarkom, leiomyosarkom, monofasiskt synovialt sarkom och melanom. Fibrosarkom av vuxentyp har ett fiskbensmönster mikroskopiskt och färgar för vimentin, men inte S100β. Leiomyosarkom, men inte MPNST, är immunreaktiva för desmin; Leiomyosarkom har också kärnor med en anmärkningsvärt trubbig morfologi. Epiteloidsarkom, men inte MPNST, är immunreaktiva för cytokeratin. Melanom, liksom MPNST, kan vara S100β-positiva, men är också immunreaktiva för MART-1 och PMEL. Förkortning: MPNST = malign perifer nervskidetumör. 1Kombinationen av S100β och nestin är mycket prediktiv för MPNST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De histologiska och biokemiska metoder som presenteras här ger ett ramverk för att diagnostisera och karakterisera GEM-modeller av neurofibrom och MPNST-patogenes. Under årens lopp har vi funnit att dessa metoder är mycket användbara för att bedöma patologin hos perifera nervskidasktumörer som uppstår i GEM-modeller 21,25,26. Men även om protokollen som beskrivs här är användbara för att bestämma hur exakt tumörer i GEM-modellerna rekapitulerar patologin hos sina mänskliga motsvarigheter, finns det vissa begränsningar för dessa strategier som bör uppskattas. Till att börja med visar P 0-GGFβ3-möss nästan fullständig penetrans av sin tumörfenotyp, vilket gör det relativt enkelt att få fram ett stort antal möss med neurofibrom och MPNST 21,25,26 som kan användas för genomiska studier och shRNA-screeningar på genomskala. Den höga penetransen av fenotypen i denna modell gör också P 0-GGFβ3-möss ganska användbara för prekliniska prövningar. Man bör dock vara medveten om att detta inte kommer att vara fallet för alla GEM-cancermodeller. Det är därför vi har betonat vikten av att bestämma hur stor andel av djuren som kan förutsägas utveckla tumörer. När vi arbetar med en djurmodell som mer sällan utvecklar tumörer har vi funnit det fördelaktigt att använda avbildningsmodaliteter som magnetisk resonanstomografi eller positronemissionstomografi för att definitivt identifiera djur som bär på tumörer som kan ingå i prekliniska prövningar eller andra studier. Den här metoden kan dock vara kostsam om upprepade genomsökningar krävs. Därför betonade vi också vikten av att fastställa den genomsnittliga överlevnadstiden för GEM-modellen av intresse26-förståelse när ett djur kan förväntas utveckla en tumör minskar antalet skanningar som krävs för att identifiera djur med önskad fenotyp och tillhörande kostnader.

Det är också viktigt att inse att en stor tumör i en mus fortfarande är en ganska liten mängd vävnad. I detta protokoll rekommenderar vi en process där tumörvävnaden delas upp i tredjedelar, med delar som ägnas åt histologi/immunhistokemi, etablering av tidiga passagecellkulturer och isolering av biomolekyler (proteiner, RNA, DNA) av intresse. Tumörstorleken kommer dock att variera och om tumören är ganska liten kan detta utesluta att ha tillräckligt med vävnad för att dela sig på detta sätt. I så fall måste utredaren avgöra om tumördiagnostik eller annan användning av tumörvävnad prioriteras32. Under dessa omständigheter är vår fördom att vi måste ha en korrekt diagnos för att förstå vad vi arbetar med innan vi ger oss ut på andra experiment. Vi har funnit att tumördiagnoser vanligtvis lätt kan fastställas med mindre än en tredjedel av tumören. När vi har att göra med små tumörer tar vi istället bort ett litet fragment av tumörvävnad, lindar in det i histologisk vävnad och placerar det i en vävnadskassett för att säkerställa att vävnaden inte går förlorad under bearbetningen. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att det kan leda till att utredaren undergraderar tumören om WHO-gradering önskas; Detta beror på att regioner av lägre och högre grad ofta samexisterar i cancer och om ett mycket litet prov tas kommer det erhållna betyget att bero på var tumörprovet togs ifrån.

De protokoll vi beskriver för att fastställa identitet för perifer nervskidetumör är starkt beroende av immunhistokemi. Även om det finns enstaka alternativa tillvägagångssätt som kan användas för vissa celltyper (t.ex. att utföra Unna-färgningar för att identifiera mastceller), är det inte enhetligt sant för de flesta celltyper som finns i neurofibrom och MPNST. Följaktligen måste stor försiktighet iakttas för att fastställa att de immunhistokemiska procedurer som kommer att användas har optimerats på rätt sätt. Enligt vår erfarenhet kan flera problem äventyra diagnostisk immunhistokemi. Det är mycket viktigt att prövaren utför en spädningsserie med en primär antikropp som de inte har använt tidigare. Dessutom bör en spädningsserie utföras när man använder en ny sats av en antikropp som tidigare har optimerats33. Försiktighet måste också iakttas för att säkerställa att färska satser av reagenser finns till hands. Enligt vår erfarenhet, när de åldras, är väteperoxid och DAB särskilt benägna att inte fungera korrekt, vilket kan leda till att utredaren felaktigt bestämmer att deras fläckar är negativa.

De immunhistokemiska profilerna som vi beskriver för plexiforma neurofibrom, MPNST, och de olika typer av tumörer som beaktas vid differentialdiagnos av MPNST är de som vi oftast har stött på 21,25,26,34. Men eftersom divergent differentiering inte är ovanligt i MPNST och dessa andra maligniteter, kan utredaren stöta på färgningsprofiler som skiljer sig något från vad vi beskriver här. Dessa nyanser är anledningen till att vi starkt rekommenderar att teamet som karakteriserar en ny GEM-modell för tumörbildning inkluderar en erfaren human- eller veterinärpatolog. I detta protokoll har vi tillämpat WHO-gradering på GEM och mänskliga MPNST. Vi föredrar detta graderingssystem eftersom graderingskriterierna är relativt väldefinierade och är lätta att jämföra mellan MPNST för människor och möss 2,28. Vi vill dock notera att WHO:s betygskriterier inte accepteras enhetligt av patologer. Detta beror på att det inte är klart att de tre WHO-graderna som tillämpas på MPNST är prediktiva för kliniska resultat hos patienter. På grund av detta föredrar många patologer att klassificera MPNST helt enkelt som låggradiga eller höggradiga maligniteter. Med detta tillvägagångssätt anses cirka 85 % av MPNST vara höggradiga maligniteter som kännetecknas av snabb mitotisk aktivitet, markerad cellulär atypi och hyperkromasi som kan åtföljas av tumörnekros. Låggradiga MPNST visar mindre cellularitet, hyperkromasi och mitotisk aktivitet.

Vi har funnit att allotransplantation av MPNST-celler i tidig passage är ett enkelt sätt att verifiera tumörigeniciteten hos dessa kulturer. Vissa frågor bör dock övervägas när cellerna inte etablerar ett allograft32. Enligt vår erfarenhet, medan den överväldigande majoriteten av MPNST-celler i tidig passage kommer att etablera ett allograft, har vi ibland stött på tidiga passagekulturer som inte gör det. Trots detta misslyckande visade array comparative genomic hybridization (aCGH) och helexomsekvensering att dessa tidiga passagekulturer hade flera genomiska abnormiteter som överensstämde med att de var tumörceller25,26. Vi har också hittat tidiga passagekulturer som inte är friska, oftast på grund av att kulturerna tilläts bli sammanflytande innan de skördades för ympning. Celler som skadats av ovarsam hantering (t.ex. inkuberats för länge med icke-enzymatisk celldissociationslösning pipetterad upp och ner ett överdrivet antal gånger) fungerar också dåligt när de ympas. Vi vill också notera att de tider vi har angett för etablering av transplantat är en uppskattning baserad på vår erfarenhet. Ibland har vi stött på kulturer med tidig passage som framgångsrikt etablerar allograft men som tar längre tid på sig att göra det.

Tillvägagångssätten som beskrivs ovan ger ett omfattande sätt att karakterisera viktiga aspekter av en nyutvecklad GEM-modell av perifer nervsystemets neoplasi och korrekt diagnostisera eventuella neurofibrom och MPNST som dessa djur utvecklar. De metoder som vi beskriver för att etablera MPNST-kulturer med tidig passage och använda dessa kulturer för allografering ger också tydliga bevis för tumörigeniciteten hos tumörer som identifierats i GEM-modeller. Vi vill betona att vi inte utför urvalet av enskilda kloner när vi etablerar tidiga passagekulturer. Även om vi inser att en viss selektion är oundviklig när man placerar tumörceller i odlingar, tyder dessa initiala fynd på att de mutationer som identifierats i tidiga GEM MPNST-kulturer förblir mycket lika de som finns i modertumören. Men med hjälp av aCGH har vi också funnit att om vi fortsätter att bära dessa tidiga passagekulturer under längre passager resulterar det i genomiska förändringar som börjar avvika från vad som ses i de tidigare passagerna av dessa tumörceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av anslag från National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 och R01 NS109655 till S.L.C.; R01 NS109655-03S1 till D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 till S.L.C.) och försvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086 och W81XWH-12-1-0164 till S.L.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Corning Falcon 353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) Vector Laboratories SK-400
6- well plates Corning Costar 3516
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) Invitrogen A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-500
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Caldesmon ABCAM  E89, ab32330
CD117 Cell Marque 117R-18-ASR
CD163 Leica NCL-L-CD163
CD31 ABCAM  ab29364
CD34 ABCAM  ab81289
CD86 ABCAM  ab53004
Cell Scraper Sarstedt 83.183
Cell Stripper Corning 25-056-CI
Circle Coverslip Fisher Scientific 12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) Decon Laboratories 5989-27-5
Critic Acid Fisher Scientific A104-500
Cytokeratin ABCAM  C-11, ab7753
Desmin Agilent Dako  clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution Vector Laboratories SK-4100
DMEM Corning 15-013-CV
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Fetal Calf Serum Omega Scientific FB-01
Forksolin Sigma-Aldrich F6886
Glycerol Sigma-Aldrich G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Hemacytometer Brightline-Hauser Scientific 1490
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific 327-500
Iba1 Wako Chemicals 019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse Vector Laboratories MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit Vector Laboratories MP-7401
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Isopropanol Fisher Scientific A415
Ki-67 Cell Signaling  12202
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015
Liquid Nitrogen
MART1 ABCAM  M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin Millipore  Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta In house Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin Santa Cruz Biotechnology  sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice Jackson Laboratory 5557
Nonfat Dry Milk Walmart Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice In house
Paraffin Wax Leica Paraplast 39601006
Parafilm M Sigma-Aldrich PM-999
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium) Fisher Scientific SP15-100
pH Meter Mettler Toldedo Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) Corning 20-031-CV
PMEL ABCAM  EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) Millipore Sigma 10981100ML
Rice Cooker Beech Hamilton
S100B Agilent Dako  Z0311  (now GA504)
SMA Ventana Medical Systems  clone 1A4
Sodium Chloride Fisher Scientific S640
Sodium Citrate (Dihydrate) Fisher Scientific BP327-1
Sox10 ABCAM  ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
TCF4/TCFL2  Cell Signaling  (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue ACROS Organics 348600050
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
TRIzol Invitrogen 15596026
Trypsin Corning 25-051-31

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 207
Identifiera, diagnostisera och gradera maligna perifera nervskidetumörer i genetiskt modifierade musmodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B.,… More

Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B., Fromm Longo, J., Carroll, S. L. Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models. J. Vis. Exp. (207), e65740, doi:10.3791/65740 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter