电子 von Frey 与小鼠鬼脸量表相关联，以评估 埃文西锥虫感染小鼠的异常性疼痛和疼痛

Summary

在这里，我们提出了一种方案，用于评估感染 埃文西锥虫的小鼠的伤害感受，使用电子von Frey装置作为工具，测量后爪和内脏的机械阈值。

Abstract

传染病的发病机制仍然是一个需要研究的复杂领域。在家畜中可以观察到几种临床症状的病程，例如异常性疼痛和疼痛。然而，对其途径的了解和正确的治疗需要对照实验，其中许多实验使用实验动物。测量后爪和内脏机械阈值的变化是观察啮齿动物疼痛感知变化的有用技术。戒断反应可以首先在基线测试中测量，从而更好地控制实验组。后续测试可以在诱导感染并将药物添加到方案中后进行。使用与使用面部量表相关的电子 von Frey 设备来观察疼痛样变化，可以进行简单、精确和一致的评估，以评估小鼠的异常性疼痛和疼痛。因此，使用本方法治疗 埃文西锥 虫感染的实验代表了评估实验室感染动物异常性疼痛和疼痛的有用方法，可应用于家畜动物的常规治疗。

Introduction

埃文西锥虫是该疾病的病原体，在南美洲称为“surra”或“mal-das-cadeiras”^1,2。它通常影响马和牛，但也影响野生动物，通过噬血蝙蝠、塔巴尼德和口蝇叮咬传播 ^1,3。Surra 是家畜的一种主要疾病，如果没有正确的治疗，它可能会致命，表现出非特异性临床症状，如贫血、食欲不振和体重减轻、肌肉无力和流产，这些症状可能因宿主和地理区域而异 2,4,5,6。

在疾病过程中，受感染动物的异常性疼痛和疼痛的表达仍然是一个新话题^2,7。了解这些体征背后的发病机制的冲动是通过在经典的锥虫杀虫方案中添加有效的镇痛药物来改进和完善目前使用的治疗方法的重要一步 ^5,6。在这种情况下，使用小鼠模型复制疾病的可能性代表了一个优势，因为小鼠可以很容易地保持在实验室的受控环境中，因此，产生的结果比使用牲畜的田间实验更一致。

在大量实验中，通常使用电子 von Frey （EvF） 设备来评估异常性疼痛 ^2,8,9。该装置用于评估组织对机械刺激的敏感性：一旦该装置接触动物的爪子，通过连接到该装置的 20-200 μL 尖端，记录动物收回爪子的力。

在这些实验中，啮齿动物通常被用作标准动物，大多数结果都外推到其他物种，因为大多数研究的疾病来自其他物种，在这些物种中很难进行对照研究。此外，异常性疼痛和疼痛密切相关。使用特定的面部量表来评估感染小鼠的疼痛起着重要作用，作为确认佐剂，以确认 T. evansi 感染过程中疼痛的存在 ^2,10。

在该协议中，我们展示了一种新的模型来评估实验感染 T. evansi 的小鼠的异常性疼痛和疼痛，显示出变量之间的高度相关性，因此被证明是一个强大的模型。此外，它需要少数研究人员来执行整个过程，从而减少了实验过程中人为干预的机会。它还使研究者能够在急性病程中复制目标疾病，并在实验设计中添加几种不同的治疗药物，从而在短时间内获得一致的结果。

Protocol

所有实验均使用10周龄的成年雌性瑞士小鼠（35-55g）进行。将动物饲养在聚砜笼（每个笼3-5只动物）中，房间温度受控（21±1°C），12小时光照/ 12小时黑暗循环，标准实验室食物和 水随意饮水。在每次测试中，每组分配10只动物，以证明药物治疗的一致效果。实验设计由圣卡塔琳娜州立大学（CEUA）伦理委员会提交并批准（协议编号：6019201123）。所有动物实验均符合ARRIVE指南（动物研究： 体内 实验报告），并按照国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 埃文西锥虫 的制备和接种

注意：处理受感染的血液样本、试剂和其他化合物时，请穿一次性实验室外套、手套、口罩和护目镜。

1. 打开水浴设备，在37°C的恒温下进行调节。
2. 从超冷冻室（-80°C）中取出含有保存血液样本的微量离心管。将其放入水浴中，直到血液解冻。
   注意：应使用相同的分离物感染每组不同实验中的所有小鼠，以保持相同数量的血液通道。
3. 使用含有60%D-（+）-葡萄糖（pH 7.4）的磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1M）进行连续稀释（10：1v v），直至每0.1mL达到1×10⁴ 个锥虫。在带有100x物镜²的显微镜上使用Neubauer室手动细胞计数确定寄生虫细胞的数量。
4. 使用连接到胰岛素注射器的 26 G 1/2“ 针头腹膜内接种 0.1 mL 稀释的血溶液（感染组），或相同体积的 0.9% 生理盐水载体（对照组）。

2. 电子 von Frey 设备的设置和操作

注意：请注意如何记录获得的数据。一些 EvF 设备具有特定的程序，可以将从设备获得的数据传输到其他电子设备，例如计算机、平板电脑或智能手机。

1. 打开 EvF 设备。在开始实验之前，请确保设备已充满电，观察设备屏幕上显示的电池电量，并在必要时进行充电。
2. 通过 Wi-Fi 将 EvF 设备连接到选定的电子设备，以传输和保存获得的数据。
3. 将 10 μL 聚丙烯尖端插入 EvF 装置锥体中，并通过按下带有爪子符号的按钮将读数设置为零 （0.00 g）。
4. 观察一旦被评估的组织被探测;最大施加的压力显示在 EvF 设备显示屏上。之后，通过按下带有天线符号的按钮将其传输到选定的电子设备，以实现安全录制。
5. 将读数重置为零，只需再次按下带有爪子符号的按钮，即可进行新的测量。

3. 机械阈值评估的一般注意事项

1. 在安静的房间内进行所有实验，温度控制在21°C和12小时光照/ 12小时黑暗循环，并确保通过^在一天2的同一时间执行所有评估来尊重小鼠昼夜节律周期。
2. 让同一个人同时执行基线和实验机械阈值评估，以减少偏倚并确保测量的一致性;确保实验是盲法的。
3. 将每只小鼠轻轻地放入由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成的单独腔室中，将穿孔顶部放置在5mm²网状地板支架^2,8上。
4. 让小鼠在PMMA室中适应30分钟，然后评估基线和实验机械阈值²。
5. 将网状地板支架放置在舒适的高度（在稳定的表面上），以便动物可以从四面八方接触到。确保小鼠的腹部和所有四只爪子都可以通过网状地板开口轻松触及。
6. 用吸收性材料覆盖用于分配腔室的稳定表面，以吸收或收集排尿和排便。确保在操作 EvF 设备时，研究者的手臂可以在腔室下方自由移动。

4. 基线机械阈值评估和小鼠对刺激的反应

1. 对于腹部测量，将腹部分为三个虚拟部分（颅骨、中侧和尾部区域）。选择颅骨区域（解剖学上包含肝脏）作为内脏异常性疼痛力学阈值评估的标准目标组织。对于爪子测量，请选择正确的后爪进行标准化。
2. 在感染前 48 小时对每只小鼠进行基线测量。为此，将小鼠置于包含室中，准备EvF装置，并用双手缓慢抬起探针以刺激靶向组织。
3. 逐渐增加对组织的压力，直到小鼠表现出伤害性行为。对于右后爪评估，寻找爪子缩回、爪子舔舐或四爪跳跃 ^2,8,9。对于内脏评估，寻找腹部急剧缩回，立即舔舐或抓挠探查部位，或四爪跳跃 ^2,11。
4. 通过将数据传输到包含特定 EvF 程序的选定电子设备或将其写入成绩簿中来保存获得的值。将显示重置为零并重复该过程四次以获得五次测量值⁸.
   注意：仅考虑三个相似的测量值来估计平均值²
5. 测量存在于相邻腔室中的小鼠的机械阈值，直到每只小鼠被探测五次并获得每只动物的平均值。
6. 24小时后重复基线测量，并排除平均值低于3.00g或基础测量值之间差异高于2.00g ^2,8的小鼠。
   注意：在每个实验中，每只小鼠只能选择一个靶组织，因此动物不会习惯于被探测，因为在短时间内评估的数量会相当高。

5. 实验性右后爪和内脏异常性疼痛机械阈值评估

1. 感染后 1 小时评估右后爪或内脏异常性疼痛机械阈值，以进行第 0 天评估。
2. 感染后 5 天内每 24 小时重复一次该过程。
   注意：如果要进行治疗，请在实验设计中选择一个适当的时间点。
3. 将小鼠放回原来的笼子里，以防止动物互相争斗，在测量完成后，可以 随意 使用标准的实验室食物和水。
4. 执行正态性检验以检查数据的正态分布，并进一步对收集的数据进行适当的统计分析。

6.小鼠鬼脸量表评估

1. 确保每只小鼠在容纳室内时都很容易看到，并在实验前检查每只小鼠，以确保四肢、腹部或面部没有病变，也没有被毛变化。
2. 观察小鼠的轨道区域。将睁开的眼睛归类为没有疼痛（得分 0），而当鼠标闭上眼睛时可能表示明显的疼痛（得分 2）。
3. 观察老鼠的鼻子。将正常的鼻子归类为没有疼痛，而鼻梁上存在凸起则表示明显的疼痛。
4. 观察老鼠的脸颊。将正常脸颊归类为没有疼痛，而双侧脸颊出现凸起则表示明显的疼痛。
5. 观察鼠标耳朵的位置。将圆耳朵归类为没有疼痛，而耳朵向外或向后旋转，远离面部，呈尖头形状，代表明显的疼痛。耳朵之间的空间随着疼痛评分的增加而增加。
6. 观察老鼠的胡须。将自然向下弯曲的胡须分类为没有疼痛，而将胡须向后拉到脸颊或向前拉则代表明显的疼痛。
7. 由于先天行为（例如自我修饰）可能会干扰面部表情，因此不要将这些视为与疼痛有关的行为⁸.等待鼠标停止此行为，然后再评估每个动作单元。
8. 执行正态性检验以检查数据的正态分布，并进一步对收集的数据进行适当的统计分析。
   注意：在所有实验结束时，使用氯胺酮（90mg / kg）和甲苯噻嗪（7.5mg / kg）对小鼠进行人道安乐死，腹膜内注射。在达到确认的深度麻醉计划后，他们被接受颈椎脱位手术。

Representative Results

通过电子 von Frey 装置在右后爪和内脏组织上评估的 T. evansi 感染导致的机械阈值降低
根据先前与可用 T. evansi 样品² 相关的数据，该实验进行了 5 天。感染小鼠在感染后第3天开始显示出右后爪机械阈值的显着差异，并且在感染后2天内与未感染的小鼠相比，仍然显着低于对照组（图1A）。腹部触觉敏感性的类似结果显示，感染小鼠的内脏异常性疼痛从感染后第3天开始，在感染后2天内仍明显低于对照组（图1B）。

图 1：实验感染 埃文西锥虫的小鼠的异常性疼痛评估。 （A）右后爪异常性疼痛和（B）内脏异常性疼痛。数据表示为每个实验组的 10 只动物的平均± SD。统计分析：学生 t 检验，每个时间点一次未配对分析。星号表示在考虑相同分析时间点的实验组之间存在显着差异（p < 0.05）。 请点击这里查看此图的较大版本.

通过 T. evansi 感染诱导小鼠疼痛相关的面部特征并通过小鼠鬼脸量表疼痛评估进行数值解释
感染小鼠在感染后第3天开始表现出明显的疼痛相关面部特征迹象，在参考时间点的平均得分为0.4 [0-1]。在实验过程中也观察到相同的趋势，其中感染组与对照组相比表现出显着差异，感染后第 4 天和第 5 天的平均得分分别为 0.6 [0-1] 和 1.3 [0-2]。对照组在小鼠鬼脸量表上没有像预期的那样得分。统计分析使用 Student's t 检验进行，每个时间点进行一次不配对分析，考虑 p < 0.05 的值具有显著性。此外，Pearson相关系数（r）确定了小鼠鬼脸量表疼痛评估与右后爪异常性疼痛之间或相同量表与内脏异常性疼痛之间的交互模式，其值分别为-96.35%和-84.08%。此外，小鼠鬼脸量表疼痛评估和右后爪异常疼痛或内脏异常疼痛的决定系数（R²）分别为0.9283和0.7070。

本研究与先前的数据一致，该数据证实了埃文西锥虫感染过程中存在炎症和疼痛 2,3,7,12。此外，所描述的方法提供了一种准确的方法来识别和测量小鼠的异常性疼痛和疼痛。此外，在感染小鼠中使用小鼠鬼脸量表疼痛评估表明，与右后爪异常性疼痛评估所表达的结果相比，阴性 r 非常高（90% 至 100%），而相应动物的内脏异常性疼痛评估结果为高阴性 r（70% 至 89%）¹³。同样，在感染小鼠中使用小鼠鬼脸量表疼痛评估表明，与右后爪异常性疼痛评估所表达的结果相比，R² （0.90 至 1.00） 非常强，而同一动物的内脏异常性疼痛评估结果为 R² （0.70 至 0.89）¹⁴。

Discussion

在涉及受感染动物的实验中，一个关键步骤是控制寄生虫血症水平。不同菌株的 T. evansi 在小鼠中可能以不同的方式表现，导致从急性感染到慢性感染 ^2,4,5,6。此外，感染剂量的变化可能会减少或延长小鼠的存活时间。因此，建议在实验前获得生存曲线，以确定实验的正确周期，并防止因意外的小鼠死亡事件而感到沮丧^15,16。此外，如果适用，这些数据可以确定实验的人道终点。

此外，必须使用相同的分离物来感染实验中的所有小鼠，以尊重相同数量的血液通道，如协议部分所述。同样，冷冻保存的或新鲜的感染血液可用于感染小鼠，因为一些冷冻保存的样本在水浴中解冻后可能会失活。然而，新鲜感染的血液可能会产生更快的寄生虫血症，因此会产生更早的死亡事件^17,18。

实验中的修改，例如添加锥虫杀灭剂或镇痛药，是可行的。新的组意味着更多的动物，重要的是要记住，即使是所选药物的对照组也必须提交基线测量。根据我们的经验，在第二次基线测量后，大约20-25%的小鼠被排除在实验之外，这与以前的数据一致⁸。这意味着初始动物数量必须高于实验动物数量，当评估更多组并因此估计更多的小鼠数量时，这可能是一个问题。

该模型必须考虑药代动力学和药效学。一些药物需要较长的时间才能发挥其药理作用，这可能会影响小鼠通常在平均 4 至 5 天内死亡的模型的实验设计 ^2,6。此外，如果动物为所选治疗禁食，则适应期可能是一个需要考虑的重要因素，因为它会影响药物动力学以及实验时间表和程序，如方案部分所述。

目前方法的一大改进是，一名训练有素的研究人员可以执行整个 EvF 读取程序（基线和实验测量），同时对感染或治疗保持盲法。另一名研究者必须在实验开始时进行感染。在感染程序之后，这不是必需的，因为 EvF 设备具有特定的 von Frey Wi-Fi 测量程序，仅允许一个人完全操作设备。此外，该方法比普通的Filament von Frey设备更快，更易于执行^8,19。

然而，疲劳可能是一种并发症，因为同一位研究人员必须执行所有动物读数，并且可能会在一段时间后由于重复运动而感到疲惫⁸.考虑到被 T. evansi 感染的小鼠的生存预期，不鼓励在实验设计中使用大量组。根据我们的经验，平均一次可以测量10只小鼠（取决于实验设计）不到30分钟。此外，在每个实验中，每只小鼠只能选择一个靶组织，这样动物就不会习惯于被探测，如协议部分所述，这也减少了研究者产生疲劳的机会。

此外，EvF（右后爪和内脏测量）和小鼠鬼脸量表评估都需要训练有素的研究人员。在进行实验之前，研究者必须花费很长时间进行练习。为了正确评估小鼠的面部表情变化，研究人员不仅必须知道预期的变化，而且必须知道普通小鼠的正常面部表情及其正常性和行为的变化^10,20。此外，为了使用 EvF 设备正确评估小鼠的机械阈值，研究人员必须重复几次基线测量，直到小鼠对探针刺激的反应易于识别并达到一致性 ^2,8。

该协议的未来应用涉及对被 T. evansi 感染的小鼠评估异常性疼痛和疼痛及其治疗。该模型使科学研究人员能够在实验室的受控环境中评估在牲畜小鼠中常见的疾病的疼痛相关发病机制。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe	TKL	80288090100	Used to infund solutions on laboratory animals
Accessories for von Frey analgesimeter	INSIGHT	EFF 303	Containment box with support for digital analgesimeter assessment
D-(+)-Glucose	SIGMA-ALDRICH	G7021	A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms
Digital analgesimeter	INSIGHT	von Frey Wi-Fi	The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli
Gilson type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18261	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment
Laboratory water bath	BEING INSTRUMENT	BW-22P	Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature
Phosphate buffered saline	SIGMA-ALDRICH	806552	A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications
Swiss mice (Mus musculus) from both gender	UFSC	Swiss Webster	Laboratory animals used for controlled experiments
Trypanosoma evansi cryiopreserved sample	UDESC	-	Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory
Universal type 10 µL polypropylene tip	CRALPLAST	18171	Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment