Medicine

Desmodium caudatum对胃炎大鼠胃肠道激素和肠道菌群的影响

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65744

Lan Bu*¹, Chengjia Tan*¹, Bainian Zhang¹, Jian Hu², Xuemei Zhang², Xue Han², Hui Tian¹, Xiaoyan Ma²

¹Key Laboratory for Quality Control and Evaluation of Traditional Chinese Medicine of Mianyang City, Mianyang Normal University, ²The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County

* These authors contributed equally

Summary

本方案描述了使用基于Illumina的16S rRNA基因测序分析肠道菌群的方法，并为评估草药汤剂的有效性提供了框架。

Abstract

为初步探究 尾鲷对 大鼠胃炎及肠道菌群的影响，采用经典水杨酸钠法建立慢性胃炎大鼠模型。将18只SPF大鼠分为对照组（C组）、模型组（M组）和治疗组（T组）3组。从每组大鼠中取出胃壁的病理切片。此外，通过ELISA测定各组大鼠血清中胃泌素和丙二醛的浓度。此外，通过对三组肠道细菌群落进行详细比较，采用基于Illumina的16S rRNA基因测序，探索了D . caudatum 对胃炎大鼠肠道菌群的影响。结果表明，尾醛汤可降低丙二醛含量，增加胃泌素含量。此外，还发现尾苔汤可增强肠道菌群的多样性和丰度，通过调节和恢复肠道菌群对胃炎的治疗产生积极影响。

Introduction

慢性胃炎（CG）是最常见的临床疾病之一，其特征是胃黏膜上皮的慢性和持续的炎症性变化，经常受到各种致病因素的反复攻击¹。CG的发病率在所有胃病中排名第一，占胃肠科门诊服务率的40%-60%²。此外，发病率通常随着年龄的增长而增加，尤其是在中老年人^{中 3}.毫无疑问，CG大大降低了人们的生活质量，强调了发现新治疗药物的迫切需要。

大量研究报告称，CG的发生和发展与胃肠道激素（如胃泌素（GAS）^）的分泌有关^4,5。GAS是消化道中常见的胃肠道肽激素，通过促进嗜酸性粒细胞释放组胺来刺激细胞分泌胃酸。此外，它还能改善胃粘膜的营养和血液供应，促进胃粘膜和壁细胞的增殖⁶。因此，胃泌素可以作为评价CG发展水平的指标。此外，由活性氧化物触发的脂质过氧化产物可以激活炎症细胞，导致CG。丙二醛（MDA）是一种脂质过氧化标志物，是测量氧化应激程度的常用指标。它在一定程度上反映了胃粘膜中自由基的水平。MDA水平可以表明由自由基引起的局部胃粘膜中不饱和脂肪酸^的攻击^7,8。

肠道微生态学由数百万种微生物组成，它们存在于宿主肠道中，在维持宿主健康和调节宿主免疫力方面发挥着至关重要的作用。健康的肠道菌群具有高度丰富、多样性和稳定的微生物群功能，通过参与新陈代谢作为防止病原微生物入侵的保护屏障。肠道菌群的紊乱使个体更容易患上急性和慢性胃肠道疾病^9,10。近年来，胃肠道疾病的微生物群治疗进展迅速，并显示出显著的疗效¹¹。总之，肠道菌群的考虑对于理解和解决胃肠道疾病至关重要。

民间药材作为中医药宝库中不可或缺的组成部分，对临床实践和民族医药现代化具有重要意义。Desmodium caudatum （Thunb.）的根部和整个部分在绵阳市北川羌地区长期被广泛用于缓解胃部不适。一些文章指出了用尾蛾治疗胃肠道疾病的科学依据，引用了其止血、抗氧化和胃肠道保护等作用12,13,14。然而，由于缺乏深入研究，尚未建立临床药效学机制。本文旨在基于胃肠道激素和肠道菌群研究尾曲霉治疗胃炎的效果，为其合理的临床应用提供依据。

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Protocol

动物的护理和使用程序得到了绵阳师范大学伦理委员会的批准，并严格遵守了所有有关动物伦理使用的制度和政府规定。在本研究中，使用了SPF大鼠（昆明物种，雄性和雌性，体重180-220 g）。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。所有动物都被饲养在无病原体的环境中，并可以随意获取食物。

1.试剂的制备

用电子秤称取2.5g水杨酸钠粉末（见 材料表）制备5%水杨酸钠溶液。将粉末溶解在少量蒸馏水中，并将其稀释至总体积为50mL。
制备 D. caudatum （12.8g/kg）的汤剂。称取 128 g D. caudatum （见 材料表），将其放入装有 1000 mL 实验室蒸馏水的圆底烧瓶中，并将其浓缩至最终体积为 100 mL。

2. 分组和管理

将大鼠分成不同的组，并在胃内施用所需的溶液。
注：本研究将18只大鼠（9只雄性，9只雌性）分为三组：对照组（C组）、模型组（M组）和治疗组（T组），每组6只大鼠。对照组接受生理盐水溶液，模型组接受 5% 水杨酸钠溶液，剂量为 10 mL/kg/天¹⁵ 周。治疗组用 5% 水杨酸钠溶液以 10 mL/kg/天的剂量预处理 5 周，然后以 1 mL/100 g 的剂量给予 D. caudatum 汤剂，持续^{10 天 15,16}。
在实验的最后一天，使用携带尾巴的方法¹⁷ 在干燥和无菌的微量离心管中收集大鼠的粪便，并将它们冷冻在液氮超低温冰箱中。
采样结束后，通过宫颈脱位处死大鼠（遵循机构批准的方案）。用剪刀打开腹腔，露出腹主动脉。
1. 将针头（23-25G）几乎平行地插入腹主动脉，收集血清，并将其保存在超低温冰箱中。从腹腔¹⁶ 中取出胃，并浸泡在10%福尔马林溶液中保存。
  注意：在M组中，如果胃粘膜扩张并充血并具有规则的腺体形态¹⁵，同时观察到固有层中的少量炎症细胞浸润，则慢性胃炎模型被认为是成功的。

3.胃壁病理切片

从每组大鼠身上取胃壁样本进行病理切片。随后，进行常规苏木精-伊红染色以观察和分析病理变化¹⁸。

4.血清胃肠道激素的测定

在血清样品中，按照制造商的说明使用ELISA检测胃泌素（GAS）和丙二醛（MDA）¹⁹ 的含量（参见 材料表）。使用酶标仪进行分析。

5. 粪便总DNA提取及PCR扩增纯化

使用市售的DNA分离试剂盒（参见 材料表）进行微生物DNA提取，并使用紫外-可见分光光度计¹⁶测定浓度和纯度。随后，通过 1% 琼脂糖凝胶电泳¹⁸ 评估 DNA 完整性。
使用热循环仪^PCR系统17，用引物338F（5′-ACT、CCT、ACG、GGA、GGC、AGC、AG-3′）和806R（5′-GAC、TAC、HVG、GGG、GTW、TCT、AT-3′）扩增细菌16S rRNA基因。引物是从商业来源获得的（见 材料表）。
注意：遵循PCR程序：变性（3分钟，95°C），然后是27个循环（30秒，95°C;30秒，55°C;45秒，72°C），最后延长（10分钟，72°C）。使用以下组分进行PCR反应：4μL 5× DNA 聚合酶缓冲液、2 μL 2.5 mM dNTP、0.8 μL 每种引物（5 μM）、0.4 μL DNA 聚合酶和 10 ng 模板 DNA（参见 材料表）。
分别使用 2% 琼脂糖凝胶、市售 DNA 凝胶提取试剂盒和荧光计依次提取、纯化和定量^{PCR 产物 17}。

6. 测序

注意：步骤6和步骤7按照先前发布的方法^20,21执行。

利用Illumina平台进行测序。
注意：DNA片段的一端与嵌入芯片的连接器的底座相辅相成，将其固定在芯片上。另一端随机补充另一个相邻埋地接头的底座，形成一个“桥”。
进行PCR扩增以生成DNA簇。将 DNA 扩增线性化为单链。
将改变的 DNA 聚合酶与具有四种不同荧光标记物的脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）一起引入。每个周期仅合成一个碱基。
利用激光扫描反应板的表面，并确定在每个模板序列的初始反应期间聚合的核苷酸类型。
化学裂解“荧光基团”和“终止基团”以重新建立 3' 粘性末端。随后，推进到聚合第二核苷酸。
通过分析每轮收集的荧光信号结果，获得模板DNA片段的序列。

7. 测序数据的处理

最初，修剪任何分数< Q20 的原始 fastq 数据的读取，并消除基数不确定的读取。此外，允许在精确匹配的引物中出现两次错配。随后，合并重叠>10 bp的序列。
使用 UPARSE 对相似度为 97% 的操作分类单元（OTU）进行聚类，并使用 UCHIME^20,21 去除嵌合序列。
采用 RDP 分类器算法根据 Silva （SSU123） 16S rRNA 数据库分析每个 16S rRNA 基因序列的分类，置信阈值为 70%。
分别使用 Mothur 和 Qiime 进行 Alpha 多样性分析和 Beta 多样性分析（参见 材料表）。

8. 统计分析

使用统计分析软件分析本研究中的数据（见 材料表）。采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组之间的比较，并利用最小显着差异（LSD）检验进行两组之间的比较。
在所有比较中， 将 P < 0.05 视为具有统计学意义。 P < 0.01 被认为是极其显著的。

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Representative Results

胃壁病理切片的结果如图1所示。与C组相比，M组表现出轻度胃壁萎缩和轻度炎症。然而，与M组相比，T组没有明显的炎症、肠化生或萎缩。这表明 D.caudatum 汤可以有效改善胃炎。

血清胃肠道激素测定结果如图2所示。M组丙二醛（MDA）含量显著高于C组。用 D.caudatum 汤处理后，它显着减少。胃泌素含量（GAS）明显低于C组，T组显著升高。这些结果表明， D. caudatum 汤剂可以调节胃肠道激素水平以治疗胃炎。

如表1 和图3所示，α多样性分析显示M组和T组群落之间存在显著差异。C组和T组的细菌数量高于M组，表明治疗后大鼠肠道细菌的数量和类型逐渐趋于正常水平。

物种组成分析
根据 图4A，群落条形图显示乳酸菌和norank_f__Muribaculaceae在C组中占最大比例，M组含有较高丰度的Clostridium_sensu_stricto_1和一些幽门螺杆菌。T组的群落组成与C组更相似，主要成分为乳酸菌和Romboutsia。此外，Spearman相关热图（图4B）与Circos图（图4C）相结合，揭示了C组和M组之间菌群组成的显着差异，优势菌群存在明显变化。治疗后，T组倾向于恢复到正常的菌群状态。此外，图5 显示了M组和C组之间群落组成的极端差异，胃炎大鼠肠道菌群的结构和组成发生了显着变化。处理后，C组和T组在菌群组成上有相似之处，T组和M组之间也有一些相似之处。这些结果表明， D. caudatum 汤剂可以将胃炎大鼠的肠道菌群恢复到正常或接近正常状态。

物种差异分析
从 图6A的多物种比较柱图可以看出，C组Norank_f_Muribaculaceae丰富，与M组和T组有明显差异。治疗后，T组Norank_f_Muribaculaceae数呈上升趋势。此外，M组中丰富的Clostridium_sensu_stricto_1在恶劣环境中表现出弹性。处理后，该数量显著减少，表明尾苔汤在一定程度上改善了肠道菌群的生存环境。另一方面， 图6B 中的LEfSe多级物种层次树分析表明，44个物种在组间存在显著差异。Norank_f_muribaculaceae、Clostridium_sensu_stricto_1 和 Romboutsia 分别在 C 组、M 组和 T 组中含量丰富。

图1：胃壁病理切片的结果。（A） C组胃的病理切片。（B）M组的胃病理切片。（C）T组的胃病理切片。请点击这里查看此图的较大版本.

图2：血清胃肠道激素的含量。（A）MDA（丙二醛）测定结果的条形分析图。（二）气体测定结果条形图。*P < 0.05，**P < 0.01。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3：多样性指数 T 的列克。 红色条形表示 C 组，蓝色表示 T 组，绿色表示 M 组*P < 0.05，**P < 0.01。请点击这里查看此图的较大版本.

图4：群落组成分析。（A）群落直方图分析。（B）属级群落热图分析。（C）样品与物种之间关系的Circos图分析。请点击这里查看此图的较大版本.

图5：属水平的PLS-DA分析。红色代表C组，蓝色代表T组，绿色代表M 组。

图6：物种差异分析。（A） Kruskal-Wallis H 测试条图。（B） LefSe多层次物种树状图。红色代表C组，蓝色代表T组，绿色代表M 组。

群	平均值	标准差
C	3.5201	0.63641
M	3.2755	0.28494
T	3.5388	0.29945

表1：阿尔法多样性指数结果。

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Discussion

羌族¹²人常用的民间药材，在治疗胃肠道疾病方面显示出显著的疗效。随着现代药理学研究的进步，胃肠道微生态失衡导致的菌群失衡被确定为急性和慢性胃肠道疾病的关键因素^22,23。肠道中的某些微生物在维持体内的动态平衡方面起着至关重要的作用，血清中的激素反映了身体的生理和病理状态。因此，该研究的重点是肠道菌群和胃肠道激素。

16S rRNA高通量基因测序是检测肠道微生物的主要方法。它能够检测收集样品中的微生物类型和功能，从而可以对每种肠道微生物进行准确和定量的分析。近年来，16S rRNA高通量基因测序迅速发展，被广泛应用于各种生态环境下的微生物多样性分析24,25,26。

基于Illumina的16S rRNA基因测序，通过对三组肠道细菌群落进行详细比较，研究了D. caudatum对胃炎大鼠肠道菌群的影响。现代科学研究表明，乳酸菌、norank_f__Muribaculaceae、Romboutsia和双歧杆菌是益生菌，每种益生菌都具有特定的健康益处，例如降低多种恶性肿瘤的风险，产生具有抗炎潜力的维生素K，促进多糖代谢，改善腹泻和便秘27,28,29.Clostridium_sensu_stricto_1是肠道损伤中的一种致病菌，可引起炎症和菌血症，与血液和胃肠道肿瘤密切相关³⁰。慢性胃炎和萎缩性胃炎对胃肿瘤有显著影响³¹.

β分析表明，处理后乳酸菌、norank_f__Muribaculaceae、Romboutsia、双歧杆菌和Clostridium_sensu_stricto_1的含量发生显著变化。尾蛾处理后乳酸菌、norank_f__Muribaculaceae菌和罗姆布氏菌含量显著增加，双歧杆菌和Clostridium_sensu_stricto_1含量显著降低。此外，群落条形图表明，T组的群落组成与C组的群落组成更相似。这些结果表明， D. caudatum 可以改善大鼠胃炎的患病率。然而， 尾曲霉 降低益生菌双歧杆菌含量的具体机制需要进一步研究。

ELISA 试剂盒方法具有高灵敏度、强特异性、操作简单且适用于小样本^{量 32}。本研究用于检测大鼠血清中丙二醛（MDA）和胃泌素（GAS）的含量。MDA反映了脂质过氧化的程度，间接表明了细胞损伤的程度。在患有胃炎的大鼠中，MDA水平明显高于正常大鼠，表明胃壁细胞受损。 D. caudatum 治疗显着降低了 MDA 水平，表明其在治疗胃炎方面的潜力。相反， D. caudatum 增加了降低的 GAS 水平，有助于胃炎的修复或治疗。

然而，16S rRNA高通量基因测序和ELISA试剂盒方法都存在局限性。在 16S rRNA 高通量基因测序中，低分辨率可能使区分序列高度相似的菌株或属具有挑战性，导致难以在更高的分类水平（如属、科或门³³）进行分类。对于 ELISA 试剂盒方法，通常需要稀释和洗涤等样品预处理步骤，这会引入潜在的误差和可变性³⁴。

这项研究表明， D. caudatum 可以通过调节胃肠道激素和肠道菌群来治疗胃炎，为其广泛的临床应用提供了见解。然而，未来的研究应该深入研究其他胃肠道激素、调节肠道菌群的机制以及所涉及的有效化学物质。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

本工作由四川省科技厅重点研发项目（2020YFS0539）资助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha diversity analysis	Mothur 1.30.2
AxyPrep deoxyribonucleic acid (DNA) gel extraction kit	Axygen Biosciences	AP-GX-50
Beta diversity analysis	Qiime 1.9.1
Cryogenic refrigerator	Forma-86C ULT freezer
Desmodium caudatum	The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County
E.Z.N.A. soil kit	Omega Bio-tek	D5625-01
Illumina MiSeq Platform	Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan Spectrum	spectraMax i3
OTU clustering	Uparse 7.0.1090
OTU statistics	Usearch 7.0
PCR instrument	TransGen AP221-02
PCR instrument	ABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST double-stranded DNA (dsDNA) system	Promega Corp.
Sequence classification annotation	RDP Classifier 2.11
Sodium salicylate	Sichuan Xilong Chemical Co., Ltd	54-21-7
SPF rats	Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0	IBM