Intratekal injektion af nyfødt mus til genomredigering og lægemiddelafgivelse
Summary
Denne protokol skitserer trinvise instruktioner til udførelse af intratekale injektioner i neonatale mus til genredigering og lægemiddelafgivelse.
Abstract
Intratekal injektion er en almindeligt anvendt procedure i både pædiatriske og voksne klinikker, der tjener som et effektivt middel til at administrere medicin og behandlinger. Ved direkte at levere medicin og behandlinger i cerebrospinalvæsken i centralnervesystemet opnår denne metode højere lokaliserede lægemiddelkoncentrationer, samtidig med at systemiske bivirkninger reduceres sammenlignet med andre ruter såsom intravenøse, subkutane eller intramuskulære injektioner. Dens betydning strækker sig ud over kliniske indstillinger, da intratekal injektion spiller en afgørende rolle i prækliniske undersøgelser med fokus på behandling af neurogenetiske lidelser hos gnavere og andre store dyr, herunder ikke-menneskelige primater. På trods af den udbredte anvendelse udgør intratekal injektion hos unge, især nyfødte hvalpe, betydelige tekniske udfordringer på grund af deres lille størrelse og skrøbelige karakter. Vellykket og pålidelig administration af intratekale injektioner hos nyfødte mus kræver omhyggelig opmærksomhed på detaljer og omhyggelig overvejelse af forskellige faktorer. Der er således et afgørende behov for en standardiseret protokol, der ikke kun giver instruktioner, men også fremhæver vigtige tekniske overvejelser og god laboratoriepraksis for at sikre proceduremæssig konsistens samt dyrenes sikkerhed og velfærd.
For at imødekomme dette uopfyldte behov præsenterer vi en detaljeret og omfattende protokol til udførelse af intratekale injektioner specifikt hos nyfødte hvalpe på postnatal dag 1 (P1). Ved at følge de trinvise instruktioner kan forskere med sikkerhed udføre intratekale injektioner hos nyfødte hvalpe, hvilket muliggør nøjagtig levering af lægemidler, antisense oligoer og vira til genudskiftning eller genomredigeringsbaserede behandlinger. Desuden understreges vigtigheden af at overholde god laboratoriepraksis for at opretholde dyrenes velfærd og sikre pålidelige forsøgsresultater. Denne protokol har til formål at løse de tekniske udfordringer forbundet med intratekale injektioner i nyfødte mus, hvilket i sidste ende letter fremskridt inden for neurogenetisk forskning, der sigter mod at udvikle potentielle terapeutiske interventioner.
Introduction
Intratekal (IT) injektion er en almindelig klinisk procedure, der anvendes til at administrere medicin, opsamle cerebrospinalvæske og opretholde intrakranielt tryk hos både pædiatriske og voksne patienter i klinik 1,2. Administration af medicin via intratekal injektion er en effektiv tilgang til at øge medicinkoncentrationerne i centralnervesystemet (CNS), samtidig med at systemisk eksponering minimeres. Derfor forbedrer denne metode terapeutisk effekt og reducerer bivirkninger, især for temperaturfølsomme og korte halveringstider3.
I prækliniske undersøgelser, der tester nye lægemidler og behandlinger ved hjælp af gnavermodeller, er det bydende nødvendigt at anvende en pålidelig metode til lægemiddeladministration, der giver større præcision og resultatreproducerbarhed 4,5. For prækliniske undersøgelser, der evaluerer nye behandlinger for neurogenetiske og neuroudviklingsforstyrrelser, er tidlig behandling afgørende for indledende proof-of-concept-undersøgelser, fordi tidligere interventioner typisk forudsiges at give mere gunstige resultater 6,7,8.
Sammenlignet med konventionelle intracerebroventrikulære (ICV) injektioner bærer IT-injektioner betydeligt lavere risici, da de undgår behovet for direkte penetration gennem hjernebarken. Denne fordel reducerer væsentligt den potentielle skade på regionalt kortikalt væv og omgivende nerver. Desuden giver IT-injektioner mulighed for mindst en femdobling af den administrative mængde medicin gennem en enkelt injektion, hvilket i høj grad forbedrer gennemførligheden af gentagne administrationer. På grund af den lille størrelse og skrøbelige karakter af nyfødte mus er det imidlertid teknisk udfordrende at udføre intratekale injektioner hos nyfødte hvalpe og kræver specialiserede teknikker, udstyr og omhyggelig håndtering.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol med trinvise instruktioner til udførelse af intratekale injektioner hos P1 nyfødte hvalpe. De vigtigste overvejelser og god laboratoriepraksis fremhæves her for at sikre ensartet administration og dyrenes sikkerhed og trivsel under forsøget. Ved at følge denne protokol kan forskere trygt udføre eksperimenter med præcision og reproducerbarhed, samtidig med at eventuelle potentielle risici eller ubehag for dyrene minimeres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet er en trin-for-trin procedure for intratekal injektion i neonatale mus (P1), hvilket resulterer i udbredt lægemiddelfordeling i deres hjerner. I sammenligning med den almindelige intracerebroventrikulære injektionsmetode til levering af medicin til neonatale mus, som indebærer piercing af hjernebarken11, undgår intratekal injektion direkte skade på neonatal musehjerne på grund af nåleindtrængning. På grund af minimal invasivitet kan intratekal injektion udføres gentagne gange, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL er støttet af Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoc Fellowship. YHJ er også støttet af FAST og NIH Grant R01HD110195 og R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
