Summary

Интратекальная инъекция новорожденной мыши для редактирования генома и доставки лекарств

Published: March 08, 2024
doi:

Summary

В настоящем протоколе изложены пошаговые инструкции по выполнению интратекальных инъекций новорожденным мышам для редактирования генов и доставки лекарств.

Abstract

Интратекальная инъекция является широко используемой процедурой как в педиатрических, так и во взрослых клиниках, служащей эффективным средством для введения лекарств и лечения. Путем непосредственной доставки лекарств и методов лечения в спинномозговую жидкость центральной нервной системы, этот метод позволяет достичь более высоких локализованных концентраций лекарств при одновременном снижении системных побочных эффектов по сравнению с другими путями, такими как внутривенные, подкожные или внутримышечные инъекции. Его значение выходит за рамки клинических условий, поскольку интратекальная инъекция играет жизненно важную роль в доклинических исследованиях, направленных на лечение нейрогенетических расстройств у грызунов и других крупных животных, включая нечеловекообразных приматов. Однако, несмотря на широкое применение, интратекальные инъекции у молодых, особенно новорожденных детенышей, представляют собой значительные технические проблемы из-за их небольшого размера и хрупкой природы. Успешное и надежное введение интратекальных инъекций новорожденным мышам требует тщательного внимания к деталям и тщательного учета различных факторов. Таким образом, существует острая необходимость в стандартизированном протоколе, который не только содержит инструкции, но и освещает ключевые технические соображения и надлежащую лабораторную практику для обеспечения согласованности процедур, а также безопасности и благополучия животных.

Чтобы удовлетворить эту неудовлетворенную потребность, мы представляем подробный и всеобъемлющий протокол выполнения интратекальных инъекций, в частности, новорожденным щенкам на 1-й день после рождения (P1). Следуя пошаговым инструкциям, исследователи могут уверенно выполнять интратекальные инъекции новорожденным щенкам, обеспечивая точную доставку лекарств, антисмысловых олиго и вирусов для замены генов или лечения на основе редактирования генома. Кроме того, подчеркивается важность соблюдения надлежащей лабораторной практики для поддержания благополучия животных и обеспечения надежных результатов экспериментов. Этот протокол направлен на решение технических проблем, связанных с интратекальными инъекциями у новорожденных мышей, что в конечном итоге способствует прогрессу в области нейрогенетических исследований, направленных на разработку потенциальных терапевтических вмешательств.

Introduction

Интратекальная (ИТ) инъекция является распространенной клинической процедурой, используемой для введения лекарств, сбора спинномозговой жидкости и поддержания внутричерепного давления как у детей, так и у взрослых пациентов в клиниках 1,2. Введение лекарственных препаратов путем интратекальной инъекции является эффективным подходом для повышения концентрации лекарств в центральной нервной системе (ЦНС) при минимизации системного воздействия. Следовательно, этот метод повышает терапевтическую эффективность и уменьшает побочные эффекты, особенно для термочувствительных препаратов и препаратов с коротким периодом полувыведения3.

В доклинических исследованиях по испытанию новых лекарственных средств и методов лечения с использованием моделей грызунов необходимо использовать надежный метод введения лекарственных средств, обеспечивающий большую точность и воспроизводимость результатов 4,5. Для доклинических исследований, оценивающих новые методы лечения нейрогенетических расстройств и нарушений развития нервной системы, раннее лечение имеет решающее значение для первоначальных исследований, подтверждающих концепцию, поскольку более ранние вмешательства, как правило, дают более благоприятные исходы 6,7,8.

По сравнению с обычными внутримозговыми инъекциями (ИКВ), ИТ-инъекции сопряжены со значительно меньшими рисками, поскольку они устраняют необходимость прямого проникновения через кору головного мозга. Это преимущество существенно снижает потенциальное повреждение регионарной корковой ткани и окружающих нервов. Кроме того, ИТ-инъекции позволяют, по крайней мере, в пять раз увеличить объем вводимых лекарств за одну инъекцию, что значительно повышает возможность повторного введения. Однако из-за небольшого размера и хрупкой природы новорожденных мышей выполнение интратекальных инъекций новорожденным щенкам технически сложно и требует специализированных методов, оборудования и тщательного обращения.

В данной статье представлен подробный протокол с пошаговой инструкцией по выполнению интратекальных инъекций новорожденным щенкам P1. Здесь особое внимание уделяется ключевым соображениям и надлежащей лабораторной практике для обеспечения последовательности введения, а также безопасности и благополучия животных во время процедуры. Следуя этому протоколу, исследователи могут уверенно проводить эксперименты с точностью и воспроизводимостью, сводя к минимуму любые потенциальные риски или дискомфорт для животных.

Protocol

Описанные процедуры и протоколы соответствовали рекомендациям, изложенным в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Кроме того, процедуры получили одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию в Меди?…

Representative Results

Успешная интратекальная инъекция немедленно приводила к широкому распространению введенного раствора, хотя фактическое проникновение в клетки зависело от характера доставляемых лекарств и материалов. В этом исследовании мы использовали Fast Green для визуализации немедленных результа?…

Discussion

Описана пошаговая процедура интратекальной инъекции новорожденным мышам (Р1), приводящая к широкому распространению препарата в их головном мозге. По сравнению с распространенным методом внутримозговой инъекции для введения лекарства новорожденным мышам, который включает в себя про?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XNL поддерживается Фондом терапевтической терапии синдрома Ангельмана (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ также поддерживается FAST и NIH Grant R01HD110195 и R01MH117289.

Materials

Balance Ohaus Corporation 30253017
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664
Digital Microscope RWD DOM-1001
DPBS ThermoFisher 14190144
Fast Green Sigma F7252-5G
Heating pad RWD 69020
Needles Hamilton 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S
Syringe Hamilton 1702RN
Syringe Filters Sigma SLGVM33RS

References

  1. Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
  2. Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
  3. Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
  4. Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
  5. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
  6. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
  7. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
  8. Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
  9. Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
  10. Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
  11. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
  12. Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
  13. Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
  14. Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
  15. Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
  16. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).

Play Video

Cite This Article
Lu, X., Jiang, Y. Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery. J. Vis. Exp. (205), e65761, doi:10.3791/65761 (2024).

View Video