הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.
Abstract
הזרקה תוך-תאית היא הליך נפוץ הן במרפאות ילדים והן במרפאות מבוגרים, ומשמשת כאמצעי יעיל למתן תרופות וטיפולים. על ידי העברה ישירה של תרופות וטיפולים לנוזל השדרה של מערכת העצבים המרכזית, שיטה זו משיגה ריכוזי תרופות מקומיים גבוהים יותר תוך הפחתת תופעות לוואי מערכתיות בהשוואה למסלולים אחרים כגון זריקות תוך ורידי, תת עוריות או תוך שריריות. חשיבותו משתרעת מעבר להגדרות קליניות, שכן הזרקה תוך-תאית ממלאת תפקיד חיוני במחקרים פרה-קליניים המתמקדים בטיפול בהפרעות נוירוגנטיות במכרסמים ובבעלי חיים גדולים אחרים, כולל פרימטים שאינם אנושיים. עם זאת, למרות היישום הנרחב שלה, הזרקה intrathecal בצעירים, במיוחד גורי יילודים, מציב אתגרים טכניים משמעותיים בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי. מתן מוצלח ואמין של זריקות תוך-תיקליות בעכברים שזה עתה נולדו דורש תשומת לב קפדנית לפרטים והתחשבות זהירה בגורמים השונים. לפיכך, יש צורך חיוני בפרוטוקול סטנדרטי שלא רק מספק הוראות, אלא גם מדגיש שיקולים טכניים מרכזיים ונוהלי מעבדה טובים כדי להבטיח עקביות פרוצדורלית, כמו גם את בטיחותם ורווחתם של בעלי החיים.
כדי לענות על צורך זה שלא נענה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומקיף לביצוע זריקות תוך תאיות במיוחד בגורים שזה עתה נולדו ביום 1 שלאחר הלידה (P1). על ידי ביצוע ההוראות שלב אחר שלב, חוקרים יכולים לבצע בביטחון זריקות intrathecal בגורים יילודים, המאפשר משלוח מדויק של תרופות, אוליגוס אנטיסנס, וירוסים עבור החלפת גנים או טיפולים מבוססי עריכת גנום. יתר על כן, מודגשת החשיבות של הקפדה על שיטות מעבדה טובות כדי לשמור על רווחתם של בעלי חיים ולהבטיח תוצאות ניסוי אמינות. פרוטוקול זה נועד להתמודד עם האתגרים הטכניים הקשורים לזריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים, ובסופו של דבר להקל על התקדמות בתחום המחקר הנוירוגנטי שמטרתו לפתח התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.
Introduction
הזרקה תוך-תאית (IT) היא הליך קליני נפוץ המשמש למתן תרופות, איסוף נוזל מוחי שדרתי ושמירה על לחץ תוך גולגולתי הן בחולים ילדים והן במבוגרים במרפאות 1,2. מתן תרופות באמצעות הזרקה תוך-תאית הוא גישה יעילה להעלאת ריכוזי התרופות במערכת העצבים המרכזית (CNS) תוך מזעור החשיפה המערכתית. כתוצאה מכך, שיטה זו משפרת את היעילות הטיפולית ומפחיתה תופעות לוואי, במיוחד עבור תרופות רגישות לטמפרטורה וקצרות זמןמחצית חיים 3.
במחקרים פרה-קליניים הבודקים תרופות וטיפולים חדשים באמצעות מודלים של מכרסמים, הכרחי להשתמש בשיטה אמינה של מתן תרופות המציעה דיוק רב יותר ויכולת שחזור תוצאה 4,5. עבור מחקרים פרה-קליניים המעריכים טיפולים חדשים להפרעות נוירוגנטיות ונוירו-התפתחותיות, טיפול מוקדם הוא חיוני למחקרי הוכחת היתכנות ראשוניים מכיוון שהתערבויות מוקדמות יותר צפויות בדרך כלל להניב תוצאות חיוביות יותר 6,7,8.
בהשוואה לזריקות תוך-מוחיות קונבנציונליות (ICV), זריקות IT נושאות סיכונים נמוכים משמעותית מכיוון שהן מייתרות את הצורך בחדירה ישירה דרך קליפת המוח. יתרון זה מפחית באופן משמעותי את הנזק הפוטנציאלי לרקמת קליפת המוח האזורית ולעצבים הסובבים אותה. יתר על כן, הזרקות IT מאפשרות להגדיל לפחות פי חמישה את נפח התרופות באמצעות זריקה אחת, מה שמשפר מאוד את ההיתכנות של מתן חוזר. עם זאת, בשל גודלם הקטן ואופיים השברירי של עכברים שזה עתה נולדו, ביצוע זריקות תוך-תיקליות בגורים שזה עתה נולדו הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש טכניקות מיוחדות, ציוד וטיפול קפדני.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות intrathecal בגורי P1 שזה עתה נולדו. השיקולים המרכזיים ונוהלי מעבדה טובים מודגשים כאן כדי להבטיח את עקביות הניהול ואת הבטיחות והרווחה של בעלי החיים במהלך ההליך. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, החוקרים יכולים לבצע ניסויים בביטחון בדיוק וביכולת שחזור תוך מזעור סיכונים פוטנציאליים או אי נוחות לבעלי החיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר הליך שלב אחר שלב להזרקה תוך-תאית בעכברים יילודים (P1), וכתוצאה מכך הפצה נרחבת של תרופות במוחם. בהשוואה לשיטת ההזרקה התוך-מוחית הנפוצה למתן תרופות לעכברי יילודים, הכוללת פירסינג בקליפת המוח11, הזרקה תוך-תאית מונעת פגיעה ישירה במוח העכבר של היילוד עקב חדירת מחט. בשל פולשניות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL נתמך על ידי הקרן לפוסט-דוקטורט תרפויטי של תסמונת אנג’למן (FAST). YHJ נתמך גם על ידי FAST ו-NIH Grant R01HD110195 ו-R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
