Behavior

针灸治疗慢性缺氧诱导认知功能障碍小鼠模型

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65784

Fang Wan*¹, Zhifang Guo*^2,3, Mingye Wang⁴, Yunlong Hou^5,6, Lu Wang^3,5, Wenyan Li^4,7, Ning Kang^2,3, Pengyu Zhu⁸, Mengnan Li^5,6

¹Heilongjiang University of Chinese Medicine, ²Hebei Provincial Key Laboratory of Luobing, ³Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Disease), ⁴Hebei University of Chinese Medicine, ⁵Shijiazhuang Compound Traditional Chinese Medicine Technology Innovation Center, ⁶National Key Laboratory of Luobing Research and Innovative Chinese Medicine, ⁷Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, ⁸The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们描述了一种在慢性缺氧小鼠模型上实施轻度麻醉和针灸治疗的方案，并进行行为测试以评估治疗后的认知改变。

Abstract

中枢神经紊乱的治疗一直对医学领域构成重大挑战。针灸是一种植根于传统中医的非药物实践，需要将细针插入身体的精确穴位，通常用于治疗各种疾病。最近，针灸已成为治疗一系列神经系统疾病（包括焦虑症和呼吸系统疾病）的有前途的治疗干预措施。然而，针灸治疗慢性缺氧引起的认知功能障碍的潜力尚未得到探索。本文提出了一个全面的方案，用于建立慢性缺氧诱导的认知障碍小鼠模型、进行轻度麻醉、进行针灸治疗以及使用开放场测试和水迷宫评估行为变化和记忆能力。分步协议提供了有关准确定位和定位穴位和针头以改善认知的详细说明。通过采用该协议，研究人员可以进行系统研究，以彻底评估针灸治疗认知功能障碍的潜力。

Introduction

全球人口目前正面临严重的老龄化问题，导致认知障碍的患病率迅速增加。全球认知障碍的发病率约为每 1000 人年 53.97 例¹。血管功能障碍或循环/呼吸系统疾病引起的慢性脑缺氧仍然是年龄相关性痴呆的主要危险因素^之一2。先前的研究表明，脑缺氧可以通过改变 BACE1 表达来增加淀粉样蛋白β沉积³。此外，缺氧与神经胶质细胞失调和神经炎症有关 ^4,5。尽管这个问题越来越严重，但目前缺乏有效的西药来预防慢性缺氧引起的认知能力下降。非药物中医，特别是针灸，已被用于治疗认知障碍数千年，并在缓解神经退行性疾病方面显示出可喜的效果^6,7。百慧穴、神庭穴、祖三里穴位是治疗认知功能障碍的有效穴位^8,9。临床研究表明，电针疗法可显著改善血管性认知障碍患者的蒙特利尔认知评估（MoCA）和简易精神状态检查（MMSE）评分，有效改善认知功能障碍⁸。尽管研究表明针灸可以显着增强动脉结扎大鼠的记忆能力——急性脑缺氧模型¹⁰，急性脑缺氧模型，但没有关于针灸对任何具有慢性缺氧诱导认知障碍的啮齿动物模型的影响的报道。缺乏对该机制的研究极大地阻碍了其临床应用。

先前的研究表明，将大鼠置于缺氧环境中 8 周可以显着提高大脑中的氧化应激和炎症水平，导致记忆功能下降¹¹.本研究旨在探讨针灸对啮齿动物模型的影响，以加深我们的理解。然而，值得注意的是，在啮齿动物的针灸治疗期间通常需要麻醉，因为在反复刺激期间可能会引起躁动。长时间麻醉会显着影响小鼠的认知功能，因为大多数麻醉药物会抑制神经活动并阻碍信息处理，导致行为缺陷¹²。几项研究表明，施用 2.5% 七氟醚持续 6 小时会显着损害小鼠的空间记忆、学习能力和注意力¹³。此外，有证据表明，高剂量麻醉可能导致小鼠神经元死亡或神经损伤¹⁴。因此，必须确定一种合适的方法，以尽量减少麻醉的总使用量。在这项研究中，我们介绍了一种有效的针灸方法来治疗认知障碍小鼠，以及评估其记忆能力的行为测试。重要的是，我们提出了一种改进的预处理麻醉技术，可以有效减少实验期间施用的麻醉总剂量。

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Protocol

动物实验经河北夷陵医学研究院动物研究伦理委员会批准（批准文号：N2022148）。将体重18-22 g的雄性C57BL/6J小鼠（见 材料表）安置在河北夷陵医学研究所新药评价中心。他们每天获得正常的食物和干净的水，并暴露在人造光下12小时。房间的温度控制在20-26°C，相对湿度为40%-70%。

1.慢性缺氧小鼠模型的建立（图1）

在开始实验之前，准备正常大气压下的动物笼子和连续低氧环境的笼子。利用自动气体控制输送系统用纯氧和氮气的混合物冲洗腔室，从而建立连续的低氧环境。
注意：该系统被编程为控制电磁阀开关，从而确保在时间和浓度方面精确输送气体。
将小鼠随机分为三组：对照组（Con），模型组（CH）和电针灸组（EA + CH）。将对照和模型/电针灸小鼠分别放置在两个笼子中，每个笼子有10只小鼠。将光照周期保持在 12 小时/12 小时（亮/暗）。
注意：对照组（Con）未诱导治疗或缺氧。模型组（CH）由慢性缺氧小鼠组成。电针灸组（EA + CH）包括用电针治疗的缺氧诱导小鼠。
对于慢性缺氧，利用数字氧气计调节气体流速并保持 10% 的氧气浓度，建立低氧室的参数。在上午9：00将动物置于低氧室中，并在下午5：00将其移出，从而每天连续暴露于低氧8小时，持续3个月。
注意：在设置氮气输送以降低氧气浓度时，建议缓慢进行以防止立即过量引入氮气，因为这会导致动物死亡。
使用组织学检查和行为测试评估慢性缺氧诱导的认知功能障碍模型：开放场地测试¹⁵ 和水迷宫测试¹⁶。

2.麻醉（图2）

准备小动物麻醉机（见 材料表）和恒温加热垫。
注意：在麻醉期间，动物容易出现体温过低，这强调了使用恒温加热垫进行绝缘的必要性。
将小鼠置于麻醉诱导箱中，并用2%-2.5%异氟醚在氧气中快速诱导约1分钟。
注意：这种短期预处理是确保小鼠能够在低浓度剂量下长时间茁壮成长的关键步骤。
一旦它们的兴奋性降低，捏住鼠标的脚趾以检查其反射。然后，将鼠标转移到恒温加热垫（37°C）上。
将麻醉流速调节至约0.5%浓度。将麻醉机连接到鼠标的嘴和鼻子。在确保维持麻醉的同时进行电针治疗。
注意：当小鼠停止眨眼时，麻醉效果得到确认。麻醉效果可以持续至少30分钟。

3.电针治疗

为有效改善认知功能障碍，应根据中医理论和临床经验，选择特定的穴位，如百会（GV20）、神庭（GV24）、双侧祖三里（ST36）（图3）。在建模过程完成前 2 周进行电针治疗。
1. 将 GV20 穴位定位在前额的中线上，在连接耳尖的线的中点⁷.针灸针插入的深度必须为 2 毫米。
2. 将 GV24 穴位定位在前额中线鼠标眼睛中点正上方 1.3 毫米处¹⁷.针灸针插入的深度必须为 2 毫米。
3. 将 ST36 穴位定位在膝关节外侧，腓骨头下方约 2 毫米处^18,19。针灸针插入的深度必须为3-4毫米。
为该过程准备一次性针灸针（见 材料表）和电针灸设备（见 材料表）（图4）。
将小鼠置于俯卧位，在0.5%异氟烷的轻度麻醉下，确保其头部和四肢固定。用右手握住一根不锈钢针（直径：0.18 毫米;长度：7 毫米），用拇指、食指和中指。
在 GV20 和 GV24 穴位横向进行针灸 2 mm 深度，用左手抬起小鼠头部的皮肤。通过触摸鼠标膝关节外侧的腓骨头并用左手拇指按压皮肤，垂直刺穿 ST36 穴位 3-4 毫米深。
注意：对于位于头部的穴位，建议按 GV24 和 GV20 的顺序插入针头。该订单有助于操作便利。穴位是离散的解剖位置，而不是静止的穴位。因此，针头插入角度的轻微偏差对治疗效果没有影响，在临床环境中接受电针治疗的患者中也类似。
将电子针灸装置连接到针头上，GV20和左侧ST36连接到一个电极组，GV24和右侧ST36连接到另一个电极组（图4）。选择连续波模式，电流强度为 2 mA，频率为 2 Hz^20,21。通过观察穴位的局部轻度震颤和鼠标的安静耐受性来确认理想的治疗方法。
1. 连接电针灸器械时，连接针的近端。这有助于最大限度地减少连接线重量造成的影响，从而防止针头脱落。如果需要，使用胶带固定水平插入的针头和连接线。
每天进行每日治疗，每次30分钟，连续6天，每个治疗周期之间休息一天。

4. 开放场测试（图5）

注：开放场测试是一种常规方法，用于评估实验动物在新奇和不熟悉环境中的自主行为、探索行为、认知能力和焦虑行为²².它由一个露天反应箱和一个记录装置组成。

要进行测试，请准备一个尺寸为 50 厘米× 50 厘米× 30 厘米的白壁立方体，底部分为 25 个相等的正方形，尺寸为 10 厘米× 10 厘米。
将鼠标放入空旷的野外反应箱中进行驯化。让鼠标在适应期探索测试室并熟悉新环境。在使小鼠适应实验环境1小时后进行露天试验。
注意：这保证了由环境变化引起的焦虑或压力的最大化，从而在随后的行为评估中实现更精确的结果。
将鼠标放在盒子的中央，让鼠标适应环境2分钟后监测10分钟。
1. 使用视频跟踪系统（见 材料表）记录鼠标的移动轨迹、行进的总距离、在中心区域花费的时间、穿过中心区域的速度以及测试期间进入中心区域的次数。
2. 按照视频跟踪系统产品手册中的说明进行相关操作。每只鼠标都经过一次测试，并从盒子内的同一位置开始探索。
3. 每次测试后，用 75% 乙醇清洁开放的场地箱，以防止使用鼠标时因气味干扰而导致的任何错误结果。

5. 水迷宫（图5）

注：在涉及小鼠的实验中，水迷宫测试经常被用作行为评估工具，以评估其空间学习和记忆能力²³。

准备一个直径为120厘米，深度为30厘米的圆形水箱。将水箱分为四个相等的象限：I、II、III 和 IV。如果在实验中使用黑鼠，请使用白色水箱;对于白鼠，请使用黑色水箱。
在圆形水箱周围放置窗帘，以防止鼠标在测试过程中看到研究人员。
在水箱的顶面放置不同的标记，作为空间定位的视觉提示。确保这些标记在整个实验过程中保持静止，以保持一致性。
在水箱的象限III中放置一个直径为10厘米的圆形平台作为指定的目标区域。确保平台可以轻松移动并固定在任何所需位置。
在整个实验过程中，将水引入水箱，同时保持22-24°C的温度范围。
1. 确保水位始终保持在目标平台上方 1 厘米。在水中加入 20% 浓度的无毒二氧化钛，以在黑色小鼠和白色背景之间实现鲜明对比。这种对比度有助于相机记录鼠标的移动和相关参数。
通过依次将每只鼠标放置在象限 I、II、III 和 IV 中，进行为期 5 天的连续空间探索测试。
1. 将鼠标朝向墙壁。远离迷宫，以防止鼠标使用实验者的位置作为参考点。记录鼠标找到平台所需的时间。
2. 如果鼠标未能在 90 秒内找到水下平台，请将鼠标引导到平台并提供 30 秒的学习时间。此外，将延迟期记录为 90 秒。
3. 如果鼠标在 90 秒内找到水下平台，让它在平台上停留 10 秒进行学习，然后再将其从水箱中取出。
4. 用毛巾擦干鼠标并将其放回笼子。
5. 每 20 分钟轮换每个鼠标在每个象限中的位置。使用视频跟踪系统（见 材料表）记录每只鼠标的游泳距离、速度和找到平台所需的时间（延迟期），按照产品手册中的说明执行相关操作。
6. 在第 1 天将平台设置在水面以上 1 厘米处。在第 2-5 天将平台放置在水面以下 1 厘米的深度。
在第 6 天，将平台从目标象限中移除并进行空间探索测试。
1. 将鼠标放在象限 I 中自由探索 90 秒。计算机记录鼠标的游泳轨迹、在目标象限停留的时间以及它穿过平台的次数。
  注意：为了尽量减少人为因素引起的实验误差，在水迷宫实验中保持参考点的位置固定是很重要的。此外，实验者在将小鼠放入水中后应立即撤退。实验完成后，应用毛巾擦干小鼠并放回笼子中以保持温暖。

6.苏木精和伊红（HE）染色 （图6）

注意：海马区域的组织学检查有助于评估缺氧模型的建立并确定针灸治疗的疗效。

行为实验后，用腹膜内注射20mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，并用10%多聚甲醛溶液灌注（见 材料表）以确保完全灌注。分离脑组织，在室温（RT）下浸入10%多聚甲醛溶液中3天，达到固定效果。
将大脑样本放入嵌入盒中。随后，用流水洗涤处理过的脑样品6小时。
使用自动组织处理器使用一系列浓度递增的酒精溶液对样品进行脱水，即 60% 乙醇 1 小时、70% 乙醇 1 小时、90% 乙醇 1 小时、95% 乙醇 2 小时，最后 100% 乙醇 2 小时。
将组织标本浸入二甲苯中2小时以达到透明度。随后，在脱水过程完成后，将透化样品转移到加热至60°C的石蜡中3小时。最后，将它们嵌入自动处理器中。
使用旋转切片机获得 4 μm 切片。随后，对切片进行苏木精染色3-8分钟，然后进行曙红染色1-3分钟。
依次将染色切片转移到纯酒精和二甲苯的分离容器中。然后，用中性胶密封并固定染色切片，准备在光学显微镜下进行病理检查。
使用载玻片扫描仪（参见 材料表）扫描切片。随后，利用观察软件获得海马区域的HE染色结果。比较神经元的排列和神经元核的凝聚。

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Representative Results

在开阔场实验中表征小鼠运动轨迹
轨迹图显示，正常组中的小鼠表现出在陌生环境中探索的强烈倾向。他们的活动轨迹主要集中在角落，同时覆盖整个空地（左图）。相比之下，长期缺氧模型组的小鼠表现出探索新环境的欲望显着减弱。它们主要在角落里徘徊，没有表现出任何朝向空旷场地中心（中间面板）的探索行为。针灸治疗后，缺氧诱导的小鼠的探索活动得到改善，并且它们向开阔场地中心冒险的行为恢复（右图）（图5A）。

小鼠空间学习和记忆的表征
在正常组中，小鼠在目标象限中花费的时间相对较长，并且更频繁地穿过平台，如轨迹图（左图）所示。与正常组相比，长期缺氧模型组小鼠表现出较弱的空间记忆能力，如它们无法在指定时间内定位目标象限（中图）所示。针灸治疗后，小鼠缺氧诱导的空间记忆能力显著改善。他们表现出更有组织的探索行为，并且在目标象限（右图）中花费的时间明显更长（图5B）。

小鼠脑的组织学检查
在对照组中，小鼠海马区神经元的排列（左上图）显示出规律性，而在长期缺氧模型组（右上图）中则被破坏。相反，治疗组在神经元排列方面表现出改善（下图）。此外，与对照组相比，模型组小鼠神经元核的收缩加剧，但这种影响在治疗组中部分缓解。（图 6）。

图1：缺氧诱导认知障碍小鼠模型的建立。小鼠从第1天到第90天暴露于缺氧状态。从第75天开始每天进行电针治疗，每个治疗周期持续6天，共2个治疗周期。周期之间有 1 天的休息时间。行为测试在第 93 天进行。可以在第 65 天进行组织学检查和行为测试，以确认模型在海马区域的建立。缩写：星期一：月。请点击这里查看此图的较大版本.

图2：电针灸前的麻醉预处理。在进行电针治疗之前，使用（A）麻醉装置对小鼠进行麻醉。然后将小鼠放入（B）室中，室中含有（C）2%异氟烷。（D）与经典麻醉方法相比，改良麻醉方法的持续时间更短。（E）接受轻度麻醉的小鼠保留其对足部刺激的反应。请点击这里查看此图的较大版本.

图3：小鼠头部穴位的解剖结构。该图描绘了GV20（百会）、GV24（神庭）和ST36（祖三里）在小鼠中的解剖位置。（A）显示额骨和顶骨的小鼠头部解剖视图。（B）显示胫骨、腓骨和腓骨头的小鼠腿部解剖视图。（C）鼠头上穴位的位置。（D） GV20位于前额的中线，耳尖之间的中点，直接在顶骨的顶部。GV24位于前额的中线，就在额骨和顶骨交界处的前方。ST36位于后腿外侧，腓骨头下方约2mm。请点击这里查看此图的较大版本.

图4：电针治疗。小鼠在麻醉下在GV20（百会）、GV24（神庭）和双侧ST36（祖三里）的特定点接受针刺刺激。请点击这里查看此图的较大版本.

图5：电针治疗后露天试验和水迷宫试验的代表性结果。（A）进行露天试验，以评估接受慢性缺氧（CH）和针灸（EA）治疗的小鼠的行为变化。从测试中生成了三个具有代表性的轨迹图。（B）进行水迷宫试验，评价长期缺氧针灸治疗小鼠的空间记忆。从测试中生成了三个具有代表性的轨迹图。请点击这里查看此图的较大版本.

图6：电针治疗后小鼠脑的组织学检查。对照组（左上图）、缺氧组（右上图）和治疗组（下图）小鼠的组织学图片。比例尺：100 μm。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

针灸是一种起源于2000多年前中国的非药物医学实践，涉及将细针插入身体的特定穴位，称为穴位。这些点被认为通过通道或经络连接，身体的生命能量或“气”通过这些通道或经络流动²⁴.通过刺激这些穴位，针灸旨在恢复身体的平衡与和谐。它已被证明可以有效治疗各种疾病，包括慢性疼痛、焦虑/抑郁、消化问题、月经来潮和呼吸系统疾病 25,26,27,28,29。近年来，针灸已成为治疗神经元疾病（包括认知功能障碍）的有效治疗干预措施。多项研究表明，它能够调节神经递质、增加脑血流量、减少氧化应激和增强神经可塑性 20,30,31,32。因此，它越来越被认为是一种安全有效的治疗选择，特别是当与传统医疗护理一起使用^{时 33}.然而，尽管针灸历史悠久且使用广泛，但针灸的作用机制仍不完全清楚。一种理论认为，针灸可以刺激内啡肽的释放，内啡肽是人体的天然止痛药，从而减轻疼痛并促进幸福感³⁴。另一种理论认为，针灸可能会影响自主神经系统，自主神经系统调节各种不自主的身体机能^35,36。尽管我们对针灸机制的理解仍在发展中，但科学家们越来越认识到，针灸的标准化实验室方法，特别是使用啮齿动物模型，对于指导该领域的研究至关重要。

选择合适的麻醉方案是在小鼠模型中进行针灸的最初关键步骤。传统方案通常涉及持续的高剂量麻醉，这可能对小鼠的神经系统产生显着影响，并可能导致针灸治疗后的行为测试结果为假阴性。在这项研究中，我们提出了一种改进的方案，利用密封的麻醉箱对小鼠进行气体麻醉，直到它们失去知觉。随后，在针灸治疗期间使用低剂量麻醉剂保持稳定状态。这种方法有助于最大限度地减少因过度麻醉剂量引起的功能和行为异常，并提高实验的准确性。此外，研究人员可以选择异氟醚代替氯胺酮和甲苯噻嗪，因为它提供更快的恢复时间并降低与氯胺酮和甲苯噻嗪相关的全身毒性风险³⁷.但是，需要注意的是，麻醉引起的假阴性结果仍可能发生。即使是连续持续 2 周的轻度麻醉也会对认知产生负面影响³⁸.为了更准确地评估治疗的有效性，研究人员可以纳入一组额外的麻醉小鼠，这些小鼠没有接受治疗以进行比较。小鼠针灸治疗的另一个关键方面是确定穴位的组合。人类中枢神经系统疾病常用的穴位有百会（GV20）、银堂（EX-HN3）、神庭（GV24）和祖三里（ST36）39,40,41。在这项研究中，我们重点纳入了百会（GV20）、神庭（GV24）和祖三里（ST36）的治疗。尽管小鼠体型小在穴位定位方面带来了挑战，但基于解剖结构的关节定位被证明是一种有效的方法。最后，确定适当的刺激频率和强度是对小鼠进行针灸治疗的另一个关键步骤。在这项研究中，我们使用了 2 Hz 和 2 mA 中等强度的低频电针。虽然针灸的治疗效果是显而易见的，但需要进一步探索以了解其潜在的机制。

尽管针灸在治疗神经系统疾病方面具有广泛的潜在应用，但这种技术有一定的局限性。一个局限性是它高度依赖操作员的经验，当由没有经验的操作员执行时，这可能导致次优结果或对实验对象造成伤害。另一个局限性是需要改进临床针灸治疗以提高其有效性。目前，研究人员正在研究针灸与其他疗法的结合，例如药物干预和认知训练，以改善治疗结果⁴²。此外，技术进步导致了新技术的发展，例如经颅磁刺激（TMS），它可以与针灸结合使用以进一步增强认知功能⁴³。尽管存在这些局限性，针灸在治疗各种神经系统疾病方面已显示出显着的益处，并且在未来的应用中具有巨大的潜力，特别是与其他疗法结合使用时。本文提供了构建慢性缺氧诱发认知障碍小鼠模型的详细方法、针灸治疗过程和行为测试方法。这些方法可以帮助研究人员对针灸的应用和机制进行深入研究，从而促进中医药的发展。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了河北省科技计划项目（NO.E2020100001和NO.22372502D）和石家庄市高水平科技创新创业人才项目（NO.07202203）的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% paraformaldehyde solution	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	Video tracking system
C75BL/6J mice	BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	No.110322220103041767	Gender: Male, Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device	Great Wall	KWD-808 I
Hwato acupuncture needle	Suzhou Medical Appliance Factory	2655519
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22
NanoZoomer Digital Pathology	Hamamatsu Photonics K. K	C9600-01
Small animal anesthesia machine	RWD	YL-LE-A106