Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour mettre en œuvre un traitement d’anesthésie légère et d’acupuncture sur un modèle murin d’hypoxie chronique et effectuer des tests comportementaux pour évaluer les altérations cognitives post-traitement.
Abstract
Le traitement des troubles du nerf central a toujours posé des défis importants au domaine médical. L’acupuncture, une pratique non pharmacologique enracinée dans la médecine traditionnelle chinoise, implique l’insertion de fines aiguilles dans des points précis du corps et est couramment utilisée pour la gestion de diverses affections. Récemment, l’acupuncture est apparue comme une intervention thérapeutique prometteuse pour une gamme de maladies neurologiques, y compris l’anxiété et les troubles respiratoires. Cependant, le potentiel de l’acupuncture dans le traitement du dysfonctionnement cognitif induit par l’hypoxie chronique n’a pas encore été exploré. Cet article présente un protocole complet pour établir un modèle murin de déficience cognitive chronique induite par l’hypoxie, administrer une anesthésie légère, effectuer un traitement d’acupuncture et évaluer les changements de comportement et les capacités de mémoire à l’aide de tests en plein champ et de labyrinthes aquatiques. Le protocole étape par étape fournit des instructions détaillées sur la localisation et le positionnement précis des points d’acupuncture et des aiguilles pour l’amélioration cognitive. En utilisant ce protocole, les chercheurs peuvent mener des études systématiques pour évaluer en profondeur le potentiel thérapeutique de l’acupuncture pour le dysfonctionnement cognitif.
Introduction
La population mondiale est actuellement confrontée à un problème critique de vieillissement, entraînant une augmentation rapide de la prévalence des troubles cognitifs. L’incidence mondiale des troubles cognitifs est d’environ 53,97 pour 1000 années-personnes1. L’hypoxie cérébrale chronique causée par un dysfonctionnement vasculaire ou des troubles circulatoires/respiratoires reste l’un des principaux facteurs de risque de démence liée à l’âge2. Des études antérieures ont démontré que l’hypoxie cérébrale peut augmenter le dépôt de β amyloïde en modifiant l’expression3 de BACE1. De plus, l’hypoxie a été associée à un dérèglement des cellules gliales et à une neuroinflammation 4,5. Malgré l’ampleur croissante de ce problème, il n’existe actuellement aucun médicament occidental efficace pour prévenir le déclin cognitif induit par l’hypoxie chronique. La médecine traditionnelle chinoise non pharmacologique, en particulier l’acupuncture, est utilisée depuis des milliers d’années pour traiter les troubles cognitifs et a montré des résultats prometteurs dans le soulagement des maladies neurodégénératives 6,7. Les points d’acupuncture Baihui, Shenting et Zusanli sont des points efficaces pour traiter le dysfonctionnement cognitif 8,9. Des études cliniques ont démontré que la thérapie par électro-acupuncture améliore significativement les scores de l’évaluation cognitive de Montréal (MoCA) et du mini-examen de l’état mental (MMSE) chez les patients atteints de troubles cognitifs vasculaires et améliore efficacement le dysfonctionnement cognitif8. Bien que des études aient suggéré que l’acupuncture peut améliorer considérablement la capacité de mémoire des rats atteints de ligature artérielle - un modèle d’hypoxie cérébrale aiguë10, un modèle d’hypoxie cérébrale aiguë, il n’y a aucun rapport sur les effets de l’acupuncture dans un modèle de rongeur présentant des troubles cognitifs induits par l’hypoxie chronique. Le manque de recherche sur le mécanisme a considérablement entravé son application clinique.
Des recherches antérieures ont démontré que le fait de soumettre des rats à un environnement hypoxique pendant une période de 8 semaines peut augmenter considérablement les niveaux de stress oxydatif et d’inflammation dans le cerveau, entraînant un déclin de la fonction de mémoire11. La présente étude vise à étudier l’impact de l’acupuncture sur des modèles de rongeurs afin d’approfondir notre compréhension. Il convient toutefois de noter que l’anesthésie est généralement nécessaire pendant le traitement d’acupuncture chez les rongeurs en raison du potentiel d’agitation lors de stimulations répétées. L’anesthésie prolongée peut avoir un impact significatif sur la fonction cognitive chez la souris, car la plupart des médicaments anesthésiques peuvent supprimer l’activité neuronale et entraver le traitement de l’information, entraînant des déficits comportementaux12. Plusieurs études ont montré que l’administration de 2,5 % de sévoflurane pendant une durée de 6 h peut notamment altérer la mémoire spatiale, la capacité d’apprentissage et l’attention chez la souris13. De plus, les preuves suggèrent que de fortes doses d’anesthésie peuvent entraîner la mort neuronale ou des lésions nerveuses chez la souris14. Par conséquent, il est impératif d’identifier une approche appropriée pour minimiser la quantité globale d’anesthésie utilisée. Dans cette étude, nous introduisons une méthode d’acupuncture efficace pour traiter les souris atteintes de troubles cognitifs, ainsi que des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités de mémoire. Il est important de noter que nous présentons une technique d’anesthésie de prétraitement modifiée qui peut réduire efficacement la dose totale d’anesthésie administrée pendant l’expérience.
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Protocol
Les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité de la recherche animale et de l’éthique de l’Institut de recherche médicale du Hebei Yiling (numéro d’agrément : N2022148). Des souris C57BL/6J mâles pesant de 18 à 22 g (voir tableau des matériaux) ont été hébergées dans le nouveau centre d’évaluation des médicaments de l’Institut de recherche médicale Hebei Yiling. Ils ont reçu de la nourriture normale et de l’eau propre et ont été exposés à la lumière artificielle pendant 12 heures par jour. Les pièces ont maintenu une plage de température contrôlée de 20 à 26 °C et une humidité relative de 40 % à 70 %.
1. Mise en place d’un modèle murin d’hypoxie chronique (Figure 1)
- Avant de commencer l’expérience, préparez des cages pour animaux sous pression atmosphérique normale et des cages avec un environnement continu à faible teneur en oxygène. Établissez un environnement continu à faible teneur en oxygène en utilisant un système automatisé de contrôle de l’administration des gaz pour rincer la chambre avec un mélange d’oxygène pur et d’azote.
REMARQUE : Ce système est programmé pour contrôler l’interrupteur électromagnétique de la vanne, assurant ainsi une livraison précise du gaz en termes de temps et de concentration. - Divisez au hasard les souris en trois groupes : un groupe témoin (Con), un groupe modèle (CH) et un groupe d’électro-acupuncture (EA + CH). Placez séparément les souris témoins et les souris modèles/électro-acupuncture dans les deux cages, à raison de 10 souris par cage. Maintenez le cycle d’éclairage à 12 h/12 h (clair/foncé).
REMARQUE : Aucun traitement ou hypoxie n’est induit dans le groupe témoin (Con). Le groupe modèle (CH) est constitué de souris souffrant d’hypoxie chronique. Le groupe électro-acupuncture (EA + CH) comprend des souris induites par l’hypoxie traitées par électro-acupuncture. - En cas d’hypoxie chronique, établissez les paramètres de la chambre à faible teneur en oxygène en utilisant un oxygénomètre numérique pour réguler le débit de gaz et maintenir une concentration d’oxygène de 10 %. Placez les animaux dans la chambre à faible teneur en oxygène à 9h00 et retirez-les à 17h00, ce qui donne un total de 8 heures d’exposition ininterrompue à un faible taux d’oxygène par jour pendant 3 mois.
REMARQUE : Lors de la mise en place de l’administration d’azote gazeux pour réduire la concentration d’oxygène, il est conseillé de procéder lentement pour éviter une introduction excessive d’azote gazeux à la fois, car cela entraînerait la mort d’animaux. - Évaluer le modèle de dysfonctionnement cognitif induit par l’hypoxie chronique à l’aide d’un examen histologique et de tests comportementaux : le test en champ ouvert15 et le test du labyrinthe aquatique16.
2. Anesthésie (Figure 2)
- Préparez l’appareil d’anesthésie pour petits animaux (voir le tableau des matériaux) et le coussin chauffant à température constante.
REMARQUE : Pendant l’anesthésie, les animaux sont sensibles à l’hypothermie, ce qui souligne la nécessité d’utiliser un coussin chauffant à température constante pour l’isolation. - Placez la souris dans la boîte d’induction de l’anesthésie et induisez rapidement avec de l’isoflurane à 2 % à 2,5 % dans de l’oxygène (voir le tableau des matériaux) pendant environ 1 min.
REMARQUE : Ce prétraitement à court terme est une étape cruciale pour s’assurer que les souris peuvent se développer sous une faible dose de concentration pendant une période prolongée. - Une fois leur excitabilité diminuée, pincez l’orteil de la souris pour vérifier son réflexe. Ensuite, transférez la souris sur le coussin chauffant à température constante (37 °C).
- Ajustez le débit de l’anesthésie à une concentration d’environ 0,5 %. Connectez l’appareil d’anesthésie à la bouche et au nez de la souris. Procéder au traitement d’électro-acupuncture tout en assurant le maintien de l’anesthésie.
REMARQUE : L’effet de l’anesthésie a été confirmé lorsque les souris ont cessé de cligner des yeux. L’effet de l’anesthésie peut durer au moins 30 minutes.
3. Traitement d’électro-acupuncture
- Pour améliorer efficacement le dysfonctionnement cognitif, sélectionnez des points d’acupuncture spécifiques, tels que le Baihui (GV20), le Shenting (GV24) et le Zusanli bilatéral (ST36), en fonction de la théorie de la médecine traditionnelle chinoise et de l’expérience clinique (Figure 3). Administrer un traitement d’électro-acupuncture 2 semaines avant la fin du processus de modélisation.
- Localisez le point d’acupuncture GV20 sur la ligne médiane du front, au milieu d’une ligne reliant le bout des oreilles7. La profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture doit être de 2 mm.
- Localisez le point d’acupuncture GV24 à 1,3 mm directement au-dessus du point médian des yeux de la souris sur la ligne médiane du front17. La profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture doit être de 2 mm.
- Localisez le point d’acupuncture ST36 à l’extérieur de l’articulation du genou, à environ 2 mm sous la tête du péroné18,19. La profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture doit être de 3 à 4 mm.
- Préparez des aiguilles d’acupuncture jetables (voir le tableau des matériaux) et un appareil d’électro-acupuncture (voir le tableau des matériaux) pour l’intervention (figure 4).
- Placez la souris en position couchée sous anesthésie légère avec 0,5 % d’isoflurane, en veillant à ce que sa tête et ses membres soient immobilisés. Tenez une aiguille en acier inoxydable (diamètre : 0,18 mm ; longueur : 7 mm) avec la main droite, en utilisant le pouce, l’index et le majeur.
- Effectuez l’acupuncture aux points d’acupuncture GV20 et GV24 transversalement sur une profondeur de 2 mm, en soulevant la peau de la tête de la souris avec la main gauche. Percez le point d’acupuncture ST36 verticalement sur une profondeur de 3 à 4 mm en touchant la tête fibulaire sur le côté latéral de l’articulation du genou de la souris et en appuyant sur la peau avec le pouce gauche.
REMARQUE : Pour les points d’acupuncture situés sur la tête, il est conseillé d’insérer les aiguilles dans la séquence GV24 suivie de GV20. Cette commande facilite la commodité opérationnelle. Les points d’acupuncture sont des emplacements anatomiques discrets plutôt que des points fixes. Par conséquent, de légères déviations dans l’angle d’insertion de l’aiguille n’ont aucun effet sur l’efficacité thérapeutique, de la même manière que chez les patients recevant un traitement d’électro-acupuncture en milieu clinique. - Connectez l’appareil d’acupuncture électronique aux aiguilles, avec GV20 et le ST36 gauche connectés à un jeu d’électrodes et GV24 et le ST36 droit connectés à un autre (Figure 4). Sélectionnez le mode onde continue, avec une intensité de courant électrique de 2 mA et une fréquence de 2 Hz 20,21. Confirmez le traitement idéal en observant localement de légers tremblements aux points d’acupuncture et une tolérance silencieuse de la souris.
- Lors de la connexion de l’instrument d’acupuncture électrique, connectez l’extrémité proximale de l’aiguille. Cela permet de minimiser l’impact causé par le poids de la ligne de connexion et améliore par conséquent la prévention du détachement de l’aiguille. Si nécessaire, utilisez du ruban adhésif pour fixer l’aiguille insérée horizontalement et la ligne de connexion.
- Administrer le traitement quotidien pendant 30 minutes chaque jour pendant 6 jours consécutifs, avec un seul jour de repos entre chaque cycle de traitement.
4. Essai en champ libre (figure 5)
REMARQUE : Le test en champ libre est une méthode conventionnelle utilisée pour évaluer le comportement autonome, le comportement exploratoire, les capacités cognitives et le comportement anxieux des animaux de laboratoire dans des environnements nouveaux et inconnus22. Il se compose d’une boîte de réaction à champ ouvert et d’un appareil d’enregistrement.
- Pour effectuer le test, préparez un cube à parois blanches mesurant 50 cm × 50 cm × 30 cm, le fond étant divisé en 25 carrés égaux mesurant 10 cm × 10 cm.
- Placez la souris dans la boîte de réaction en champ libre pour l’acclimatation. Laissez la souris explorer la salle d’examen et familiarisez-vous avec le nouvel environnement pendant la période d’acclimatation. Effectuez le test en plein champ après avoir acclimaté la souris à l’environnement expérimental pendant 1 h.
REMARQUE : Cela garantit la minimisation de l’anxiété ou du stress induit par les altérations de l’environnement, permettant ainsi des résultats plus précis lors des évaluations comportementales ultérieures. - Placez la souris au centre de la boîte et surveillez-la pendant 10 min après avoir laissé la souris s’adapter à l’environnement pendant 2 min.
- Utilisez un système de suivi vidéo (voir Tableau des matières) pour enregistrer la trajectoire de mouvement de la souris, la distance totale parcourue, le temps passé dans la zone centrale, la vitesse de traversée de la zone centrale et le nombre d’entrées dans la zone centrale pendant le test.
- Effectuez les opérations appropriées comme indiqué dans le manuel du produit du système de suivi vidéo. Chaque souris subit un seul test et commence l’exploration à partir du même endroit dans la boîte.
- Après chaque test, nettoyez la boîte à champ ouvert avec de l’éthanol à 75 % pour éviter tout faux résultat causé par des interférences d’odeurs lors de l’utilisation d’une souris.
5. Labyrinthe aquatique (Figure 5)
REMARQUE : Le test du labyrinthe aquatique est fréquemment utilisé comme outil d’évaluation comportementale dans des expériences impliquant des souris pour évaluer leurs capacités d’apprentissage spatial et de mémoire23.
- Préparez un réservoir d’eau circulaire d’un diamètre de 120 cm et d’une profondeur de 30 cm. Divisez le réservoir en quatre quadrants égaux : I, II, III et IV. Si vous utilisez des souris noires dans l’expérience, utilisez un réservoir d’eau blanche ; Pour les souris blanches, utilisez un réservoir d’eau noire.
- Placez des rideaux autour du réservoir d’eau circulaire pour empêcher la souris de voir les chercheurs pendant le test.
- Placez différents marqueurs sur la surface supérieure du réservoir d’eau comme repères visuels pour l’orientation spatiale. Assurez-vous que ces marqueurs restent immobiles tout au long de l’expérience pour maintenir la cohérence.
- Placer une plate-forme circulaire d’un diamètre de 10 cm dans le quadrant III du réservoir d’eau comme zone cible désignée. Assurez-vous que la plate-forme peut être facilement déplacée et sécurisée à l’endroit souhaité.
- Tout au long de l’expérience, introduisez de l’eau dans le réservoir tout en maintenant une plage de température de 22 à 24 °C.
- Assurez-vous que le niveau d’eau reste constamment à 1 cm au-dessus de la plate-forme cible. Incluez une concentration de 20 % de dioxyde de titane non toxique dans l’eau pour obtenir un contraste distinct entre les souris noires et le fond blanc. Ce contraste facilite l’enregistrement par la caméra des mouvements de la souris et des paramètres pertinents.
- Effectuez un test d’exploration spatiale continue de 5 jours en plaçant séquentiellement chaque souris dans les quadrants I, II, III et IV.
- Positionnez la souris face au mur. Éloignez-vous du labyrinthe pour éviter que la souris n’utilise la position de l’expérimentateur comme point de référence. Enregistrez le temps que la souris met à trouver la plate-forme.
- Si la souris ne parvient pas à localiser la plate-forme sous-marine dans les 90 s, guidez-la vers la plate-forme et offrez-lui une période d’apprentissage de 30 s. De plus, enregistrez la période de latence à 90 s.
- Si la souris localise la plate-forme sous-marine dans les 90 s, laissez-la rester sur la plate-forme pendant 10 s pour apprendre avant de la retirer du réservoir d’eau.
- Séchez la souris avec une serviette et remettez-la dans sa cage.
- Faites pivoter l’emplacement de chaque souris dans chaque quadrant toutes les 20 minutes. Enregistrez la distance de nage, la vitesse et le temps nécessaire pour trouver la plate-forme (la période de latence) de chaque souris à l’aide du système de suivi vidéo (voir Tableau des matériaux), en effectuant les opérations pertinentes comme indiqué dans le manuel du produit.
- Placez la plate-forme à 1 cm au-dessus de la surface de l’eau le jour 1. Placez la plate-forme à une profondeur de 1 cm sous la surface de l’eau les jours 2 à 5.
- Le jour 6, retirez la plate-forme du quadrant cible et effectuez un test d’exploration spatiale.
- Placez la souris dans le quadrant I pour explorer librement pendant 90 s. L’ordinateur enregistre la trajectoire de nage de la souris, le temps passé dans le quadrant cible et le nombre de fois qu’elle traverse la plate-forme.
REMARQUE : Afin de minimiser les erreurs expérimentales causées par des facteurs humains, il est important de maintenir la position du point de référence fixe dans l’expérience du labyrinthe aquatique. De plus, l’expérimentateur doit immédiatement battre en retraite après avoir placé la souris dans l’eau. Une fois l’expérience terminée, les souris doivent être séchées avec une serviette et remises dans leurs cages pour maintenir la chaleur.
- Placez la souris dans le quadrant I pour explorer librement pendant 90 s. L’ordinateur enregistre la trajectoire de nage de la souris, le temps passé dans le quadrant cible et le nombre de fois qu’elle traverse la plate-forme.
6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) (figure 6)
REMARQUE : L’examen histologique de la région de l’hippocampe aide à évaluer l’établissement du modèle d’hypoxie et à déterminer l’efficacité du traitement d’acupuncture.
- Après l’expérience comportementale, anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 20 mg/kg de pentobarbital sodique et la perfuser avec une solution de paraformaldéhyde à 10 % (voir tableau des matériaux) pour assurer une perfusion corporelle complète. Isolez le tissu cérébral et plongez-le dans une solution de paraformaldéhyde à 10 % à température ambiante (RT) pendant 3 jours pour obtenir une fixation.
- Placez les échantillons de cerveau dans une boîte d’intégration. Ensuite, laver les échantillons de cerveau traités à l’eau courante pendant 6 h.
- Utiliser un processeur de tissus automatisé pour déshydrater les échantillons à l’aide d’une série de solutions alcooliques à concentrations croissantes, à savoir 60 % d’éthanol pendant 1 h, 70 % d’éthanol pendant 1 h, 90 % d’éthanol pendant 1 h, 95 % d’éthanol pendant 2 h et enfin, 100 % d’éthanol pendant 2 h.
- Immerger les échantillons de tissu dans du xylène pendant 2 h pour obtenir une transparence. Par la suite, une fois le processus de déshydratation terminé, transférez les échantillons perméabilisés dans de la cire de paraffine chauffée à 60 °C pendant 3 h. Enfin, intégrez-les dans un processeur automatique.
- Utilisez une trancheuse rotative pour obtenir des sections de 4 μm. Par la suite, soumettre les coupes à une coloration à l’hématoxyline pendant une durée allant de 3 à 8 min, suivie d’une coloration à l’éosine pendant 1 à 3 min.
- Transférez séquentiellement les sections colorées dans des récipients séparés d’alcool pur et de xylène. Ensuite, scellez et fixez les sections colorées avec de la gomme neutre en vue d’un examen pathologique au microscope optique.
- Utilisez un scanner de lames (voir la table des matériaux) pour numériser les tranches. Par la suite, utilisez le logiciel de visualisation pour obtenir les résultats de coloration HE pour la région de l’hippocampe. Comparez la disposition des neurones et la condensation des noyaux neuronaux.
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Representative Results
Caractérisation des trajectoires de locomotion des souris dans l’expérience en plein champ
La carte de trajectoire révèle que les souris du groupe normal présentent une profonde inclination pour l’exploration dans des environnements inconnus. Leurs trajectoires d’activité sont principalement concentrées dans les coins tout en couvrant l’ensemble du champ ouvert (panneau de gauche). En revanche, le groupe de souris modèles d’hypoxie à long terme présente un désir considérablement diminué d’explorer de nouveaux environnements. Ils s’attardent principalement dans les coins sans présenter de comportement exploratoire vers le centre du champ ouvert (panneau du milieu). Après un traitement d’acupuncture, l’activité exploratoire des souris induites par l’hypoxie montre une amélioration, et leur comportement d’aventure vers le centre du champ ouvert est rétabli (panneau de droite) (Figure 5A).
Caractérisation de l’apprentissage spatial et de la mémoire chez la souris
Dans le groupe normal, les souris ont passé relativement plus de temps dans le quadrant cible et ont traversé la plate-forme plus fréquemment, comme le montre la carte de trajectoire (panneau de gauche). Le groupe modèle hypoxique à long terme de souris a démontré des capacités de mémoire spatiale affaiblies par rapport au groupe normal, comme l’indique leur incapacité à localiser le quadrant cible dans le temps spécifié (panneau du milieu). Après un traitement d’acupuncture, les souris ont montré une amélioration significative de leurs capacités de mémoire spatiale induites par l’hypoxie. Ils ont montré un comportement exploratoire plus organisé et ont passé beaucoup plus de temps dans le quadrant cible (panneau de droite) (Figure 5B).
Examen histologique du cerveau de souris
Dans le groupe témoin, la disposition des neurones dans la région de l’hippocampe des souris (panneau supérieur gauche) a démontré une régularité, alors qu’elle a été perturbée dans le groupe modèle hypoxique à long terme (panneau supérieur droit). À l’inverse, le groupe de traitement a montré une amélioration de la disposition des neurones (panneau inférieur). De plus, le groupe modèle a montré un rétrécissement exacerbé des noyaux neuronaux de souris par rapport au groupe témoin, mais cet effet a été partiellement atténué dans le groupe de traitement. (Figure 6).
Figure 1 : Mise en place d’un modèle murin pour les troubles cognitifs induits par l’hypoxie. Les souris ont été exposées à l’hypoxie du jour 1 au jour 90. L’acupuncture électrique a été administrée quotidiennement à partir du 75e jour, chaque cycle de traitement durant 6 jours et un total de 2 cycles de traitement. Il y avait une pause d’un jour entre les cycles. Des tests comportementaux ont été effectués le jour 93. Un examen histologique et des tests comportementaux peuvent être effectués au jour 65 pour confirmer l’établissement du modèle dans la région de l’hippocampe. Abréviations : Lun : mois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Prétraitement de l’anesthésie avant l’électro-acupuncture. Avant de subir un traitement d’électro-acupuncture, les souris ont été anesthésiées à l’aide d’un appareil d’anesthésie (A). Les souris ont ensuite été placées dans une boîte de chambre (B) avec (C) 2% d’isoflurane dans la chambre. (D) La durée de la méthode d’anesthésie modifiée était plus courte que celle de la méthode d’anesthésie classique. (E) Les souris soumises à une légère anesthésie conservent leur réaction à la stimulation du pied. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Structure anatomique des points d’acupuncture sur la tête de souris. Cette figure représente les positions anatomiques de GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) et ST36 (Zusanli) chez la souris. (A) Une vue anatomique de la tête de souris montrant les os frontaux et pariétaux. (B) Une vue anatomique de la patte de souris montrant le tibia, le péroné et la tête du péroné. (C) Emplacements des points d’acupuncture sur la tête de la souris. (D) GV20 est situé sur la ligne médiane du front, au milieu entre les extrémités des oreilles et directement sur le dessus de l’os pariétal. GV24 est situé sur la ligne médiane du front, juste avant la jonction des os frontaux et pariétaux. ST36 est situé sur le côté externe de la patte arrière, à environ 2 mm sous la tête du péroné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Traitement d’électro-acupuncture. Les souris ont subi une stimulation à l’aiguille à des points spécifiques sur GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) et ST36 bilatéral (Zusanli) sous anesthésie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats représentatifs du test en champ libre et du test du labyrinthe aquatique après un traitement d’électro-acupuncture. (A) Le test en champ ouvert a été mené pour évaluer les changements de comportement chez les souris soumises à un traitement d’hypoxie chronique (CH) et d’acupuncture (EA). Trois tracés de trajectoire représentatifs ont été générés à partir du test. (B) Le test du labyrinthe aquatique a été mené pour évaluer la mémoire spatiale de souris soumises à un traitement d’hypoxie chronique et d’acupuncture. Trois tracés de trajectoire représentatifs ont été générés à partir du test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Examen histologique du cerveau de souris après traitement d’électro-acupuncture. Photos histologiques des souris du groupe témoin (panneau supérieur gauche), du groupe hypoxie (panneau supérieur droit) et du groupe de traitement (panneau inférieur). Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’acupuncture, une pratique médicale non pharmacologique originaire de Chine il y a plus de 2 000 ans, implique l’insertion de fines aiguilles dans des points spécifiques du corps appelés points d’acupuncture. On pense que ces points sont reliés par des canaux ou des méridiens à travers lesquelscircule l’énergie vitale du corps, ou « qi ». En stimulant ces points, l’acupuncture vise à rétablir l’équilibre et l’harmonie du corps. Il a été démontré qu’il traite efficacement diverses affections, notamment la douleur chronique, l’anxiété/dépression, les problèmes digestifs, les crampes menstruelles et les troubles respiratoires 25,26,27,28,29. Ces dernières années, l’acupuncture est apparue comme une intervention thérapeutique efficace pour les maladies neuronales, y compris les dysfonctionnements cognitifs. De nombreuses études ont démontré sa capacité à moduler les neurotransmetteurs, à augmenter le flux sanguin cérébral, à réduire le stress oxydatif et à améliorer la neuroplasticité 20,30,31,32. Par conséquent, il est de plus en plus reconnu comme une option de traitement sûre et efficace, en particulier lorsqu’il est utilisé en complément des soins médicaux conventionnels33. Cependant, malgré sa longue histoire et son utilisation généralisée, le mécanisme d’action de l’acupuncture reste incomplètement compris. Une théorie propose que l’acupuncture stimule la libération d’endorphines, les analgésiques naturels du corps, soulageant ainsi la douleur et favorisant un sentiment de bien-être34. Une autre théorie suggère que l’acupuncture peut affecter le système nerveux autonome, qui régule diverses fonctions corporelles involontaires35,36. Bien que notre compréhension des mécanismes de l’acupuncture soit encore en développement, les scientifiques reconnaissent de plus en plus qu’une méthodologie de laboratoire standardisée pour l’acupuncture, en particulier à l’aide de modèles de rongeurs, est essentielle pour guider la recherche dans ce domaine.
Le choix d’un protocole d’anesthésie approprié est la première étape cruciale de la réalisation de l’acupuncture dans un modèle murin. Les protocoles traditionnels impliquent souvent une anesthésie continue à haute dose, ce qui peut avoir des effets significatifs sur le système nerveux de la souris et peut entraîner des résultats de test comportemental faussement négatifs après un traitement d’acupuncture. Dans cette étude, nous proposons un protocole amélioré qui utilise une boîte d’anesthésie scellée pour anesthésier les souris jusqu’à ce qu’elles perdent connaissance. Par la suite, un état stable est maintenu à l’aide d’un anesthésique à faible dose pendant le traitement d’acupuncture. Cette méthode permet de minimiser les anomalies fonctionnelles et comportementales causées par un dosage excessif d’anesthésie et améliore la précision des expériences. De plus, les chercheurs peuvent opter pour l’isoflurane au lieu de la kétamine et de la xylazine car il offre un temps de récupération plus rapide et réduit les risques de toxicité systémique associés à la kétamine et à la xylazine37. Cependant, il est important de noter que des résultats faussement négatifs causés par l’anesthésie peuvent toujours se produire. Même une anesthésie légère se poursuivant pendant 2 semaines consécutives peut avoir un impact négatif sur la cognition38. Afin d’évaluer plus précisément l’efficacité du traitement, les chercheurs peuvent incorporer un groupe supplémentaire de souris anesthésiées qui ne reçoivent aucun traitement à des fins de comparaison. Un autre aspect critique du traitement d’acupuncture chez la souris est de déterminer la combinaison des points d’acupuncture. Les points d’acupuncture couramment utilisés pour les maladies du système nerveux central chez l’homme comprennent Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) et Zusanli (ST36)39,40,41. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’inclusion du Baihui (GV20), du Shenting (GV24) et du Zusanli (ST36) pour le traitement. Malgré les défis posés par la petite taille des souris dans la localisation des points d’acupuncture, le positionnement articulaire basé sur les structures anatomiques s’avère être une méthode efficace. Enfin, la détermination de la fréquence et de l’intensité de stimulation appropriées est une autre étape clé dans la réalisation d’un traitement d’acupuncture chez la souris. Dans cette étude, nous avons utilisé l’électro-acupuncture basse fréquence à 2 Hz et une intensité modérée de 2 mA. Bien que le résultat thérapeutique de l’acupuncture soit évident, une exploration plus approfondie est nécessaire pour comprendre son mécanisme sous-jacent.
Malgré les vastes applications potentielles de l’acupuncture dans le traitement des troubles neurologiques, cette technique présente certaines limites. L’une des limites est sa forte dépendance à l’expérience de l’opérateur, ce qui peut entraîner des résultats sous-optimaux ou nuire aux sujets expérimentaux lorsqu’il est effectué par des opérateurs inexpérimentés. Une autre limite est la nécessité d’améliorer le traitement clinique de l’acupuncture pour en accroître l’efficacité. Actuellement, les chercheurs étudient la combinaison de l’acupuncture avec d’autres thérapies, telles que les interventions pharmacologiques et l’entraînement cognitif, afin d’améliorer les résultats du traitement42. De plus, les progrès technologiques ont conduit au développement de nouvelles techniques, comme la stimulation magnétique transcrânienne (TMS), qui peut être utilisée en conjonction avec l’acupuncture pour améliorer davantage la fonction cognitive43. Malgré ces limites, l’acupuncture a montré des avantages significatifs dans le traitement de divers troubles neurologiques et présente un grand potentiel pour des applications futures, en particulier lorsqu’elle est combinée à d’autres thérapies. Cet article fournit des méthodes détaillées pour construire un modèle murin de déficience cognitive induite par l’hypoxie chronique, le processus de traitement par acupuncture et les méthodes de test comportemental. Ces méthodes peuvent aider les chercheurs à mener des études approfondies sur l’application et le mécanisme de l’acupuncture, favorisant ainsi l’avancement de la médecine traditionnelle chinoise.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme S&T du Hebei (NO.E2020100001 et NO.22372502D), le projet de haut niveau S & T Innovation and Entrepreneurship Talent de Shijiazhuang (n° 07202203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% paraformaldehyde solution | Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd | RL3234 | |
| ANY-maze | Science | SA201 | Video tracking system |
| C75BL/6J mice | BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD | No.110322220103041767 | Gender: Male, Weight: 18–22 g |
| Electroacupuncture device | Great Wall | KWD-808 I | |
| Hwato acupuncture needle | Suzhou Medical Appliance Factory | 2655519 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| NanoZoomer Digital Pathology | Hamamatsu Photonics K. K | C9600-01 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD | YL-LE-A106 |
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