Summary
一般的な呼吸器系ウイルス用の2つのプローブベースのワンステップRT-qPCRキットを紹介します。最初のアッセイは、SARS-CoV-2(N)、インフルエンザA(H1N1およびH3N2)、およびインフルエンザBに対するものです。2つ目は、SARS-Cov-2(N)とMERS(UpEとORF1a)です。これらのアッセイは、あらゆる専門ラボでうまく実施できます。
Abstract
コロナウイルス病2019(COVID-19)を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、一般市民の健康に対する深刻な脅威です。インフルエンザの季節には、SARS-CoV-2やその他の呼吸器系ウイルスの蔓延により、管理が困難な呼吸器疾患の集団的負担を引き起こす可能性があります。そのためには、呼吸器系ウイルスであるSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、中東呼吸器症候群(MERS-CoV)を、特にSARS-CoV-2、インフルエンザA、B型インフルエンザの場合、感受性集団、感染様式、臨床症候群などの同様の疫学的要因を共有するため、今後の秋から冬にかけて注意深く監視する必要があります。標的特異的なアッセイを行わないと、これらのウイルスの類似性から症例を区別することが困難になる可能性があります。したがって、これらのウイルス標的を容易に区別できる高感度で標的を絞ったマルチプレックスアッセイは、医療従事者にとって有用である。本研究では、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVを同時に検出するために、自社開発のR3TワンステップRT-qPCRキットを利用したリアルタイム逆転写酵素PCRベースのアッセイを開発しました。わずか10コピーの合成RNAで、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、MERS-CoVのターゲットを100%の特異性で同時に同定することに成功しました。このアッセイは、正確で信頼性が高く、シンプルで、高感度で、特異的であることがわかっています。開発された分析法は、病院、医療センター、診断ラボ、および研究目的で、最適化されたSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびSARS-CoV-2、MERS-CoV診断アッセイとして使用できます。
Introduction
現在進行中の新型コロナウイルス感染症2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)1として知られる新型コロナウイルスによって引き起こされています。SAR-CoV-2の強い伝染性と急速な感染力により、COVID-19のパンデミックは中国の武漢市で発生し、世界中に急速に広がりました。これは最終的に呼吸困難の徴候の始まりにつながり、死にさえつながりました2,3,4。COVID-19は213カ国以上でパンデミックと宣言されており、さまざまな調査研究で発表された論文からも明らかなように、確認された症例数の急激な増加が予想されています3,5。COVID-19は、主に感染者が環境中に放出する小さな呼吸器飛沫によって感染し、吸入や汚染された表面との密接な接触によって脆弱な個人に曝露します。これらの飛沫が目、口、鼻の粘膜に接触すると、人は感染する可能性があります6。世界保健機関(WHO)が発表した統計によると、世界中で7,600万人以上の感染が確認され、700万人という驚異的な死者が出ています7。このように、国連は、COVID-19によるパンデミックは、世界中の何十億もの人々の生活に直接影響を与え、経済的、環境的、社会的に広範囲に影響を及ぼしたため、災害に分類しました。
徹底的な検査、早期発見、接触者追跡、症例隔離などの公衆衛生イニシアチブはすべて、このパンデミックを制御下に置く上で重要であることが示されています8,9,10,11。冬季は、COVID-19に似た症状を持つインフルエンザAやBなどの他の呼吸器系ウイルスの循環が増加し、COVID-19の症例を早期に特定、追跡、隔離することが困難になります。毎年、インフルエンザAおよびBの流行は晩秋または1月上旬に始まり、季節性は予測可能です12。SARS-CoV-2ウイルスとインフルエンザウイルスには多くの疫学的特徴が共通しています。さらに、子供、高齢者、免疫不全、喘息、慢性閉塞性肺疾患、心不全および腎不全、糖尿病などの慢性併存疾患を持つ個人を含む感受性集団の類似性を共有しています12,13。これらのウイルスは、脆弱な集団だけでなく、接触経路や呼吸器飛沫の感染経路も共有しています14。インフルエンザの季節が近づくにつれて、患者はこれらの呼吸器系ウイルスの1つ以上に感染する可能性が高いと予想されます14。そのためには、SARS-CoV-2とインフルエンザウイルスのスクリーニングを、症状のある患者を隔離する前に行う必要があります。3つのウイルス(SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB)について個別に検査を行うことは、核酸の抽出と診断のためのリソースが世界的に不足しているため、不可能です。1回の反応でそれらをすべてスクリーニングするには、メソッドまたはテストを開発する必要があります。
中東呼吸器症候群(MERS)-CoVは、ヒトコロナウイルス(CoV)ファミリーのメンバーです。最初のMERS-CoVウイルス分離株は、2012年9月に急性呼吸器疾患により死亡したサウジアラビアの入院患者から採取された15。MERS-CoVの顕著なリザーバー宿主がヒトコブラクダであることを示唆する証拠があります。感染したヒトコブラクダ由来のウイルスは人畜共通感染症であり、したがって人間に感染する可能性があることが証明されています16,17。このウイルスに感染した人間は、密接な接触によって他の人に感染させる可能性があります18。2018年1月26日現在、MERS-CoVの検査で確認された症例は2143例で、そのうち750人が死亡しています19。最も典型的なMERS-CoVの症状は、咳、発熱、息切れです。MERS-CoV感染症は、肺炎、下痢、胃腸病の症状を示すことも報告されています20。現在、MERS-CoVの市販のワクチンや特異的な治療法はありません。したがって、MERS-CoVの蔓延を予防し、MERS-CoVとSARS-CoV-2疾患を区別するためには、迅速かつ正確な診断が不可欠です。
現在までに、マルチプレックスRT-PCR 21,22,23,24,25、CRISPR/Cas1226,27、CRISPR/Cas928、CRISPR/Cas329、ラテラルフロー免疫測定法30、紙ベースの生体分子センサー31、ワンポットでのシャーロック検査32、DNAアプタマー33、ループ媒介等温など、これらのウイルスを検出するための多くのアプローチが提案されている増幅(LAMP)19,34など前述の各方法には、感度と特異性の点で独自の利点と欠点があります。これらの方法の中で、核酸増幅ベースの検査であるマルチプレックスqRT-PCRが最も一般的であり、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびMERS-CoVの診断のゴールドスタンダードであると考えられています。
本研究では、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVを標準ツイスト合成ウイルスRNAを用いて効果的かつ正確かつ同時に検出するための様々なプライマーの組み合わせとプローブを設計・評価しました。MERS-CoVまたはSARS-CoV-2の標的遺伝子に対して開発されたマルチプレックスアッセイは、世界保健機関(WHO)によって推奨されています。これらの遺伝子は一般に、MERS−CoVアッセイに使用されるオープンリーディングフレーム1a(ORF1a)内の領域など、複製/転写複合体(RTC)35の形成に寄与するタンパク質および複合体をコードする。さらに、構造タンパク質は、MERS-CoVおよびSARS-Cov-2アッセイにそれぞれ使用されるエンベロープ遺伝子の上流領域(upE)およびヌクレオカプシド遺伝子(N)などの診断アッセイに利用される遺伝子によってコードされています35,36。社内のR3TワンステップRT-qPCRキットを使用して、ウイルス検出用のRT-qPCRを確立しました37。R3T ワンステップ RT-qPCR キットおよびプライマーセットのウイルス検出、感度、特異性、およびダイナミックレンジは、標準 Twist 合成 RNA の 10 倍段階希釈を使用して試験および評価されました。実用的検出の最低限界は、1反応あたり約10個の転写産物コピーでした。その結果、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびSARS-CoV-2、MERS-CoVのルーチン同時診断に、社内のR3TワンステップRT-qPCRキットとプライマー/プローブセットを正常に使用および実装できます。
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Protocol
1. Taqポリメラーゼの発現と精製
- 酵素のC末端に切断可能なヘキサ-ヒスチジンタグを有するプラスミドを構築します。
- 発現ベクター50ngを標準プロトコル38に従って大腸菌BL21-(DE3)株に形質転換する。
- 37°Cでそれぞれ2Lの2YT培地ブロスが入った4つの6Lフラスコに、OD 600が0.8または細胞番号6.4 x 108 に達するまで170rpmで振とうしながら、形質転換細胞を接種します。
- 0.5 mM のイソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド(IPTG)で Taq ポリメラーゼ発現を誘導し、さらに 16 °C で 18 時間振とうしながらインキュベートします。
- 細胞を4°C、7808 x g で10分間スピンダウンして回収します。ペレットを200 mLの氷冷Taqポリメラーゼ溶解バッファー(表1)に再懸濁し、5 mL/gの細胞ペレットに再懸濁します。
- 細胞をリゾチーム(2 mg/mLの溶解緩衝液)およびプロテアーゼ阻害剤で45分間インキュベートした後、ライセートを30 kPsiの細胞破壊剤に通し、22,040 x g で4°Cで30分間遠心分離して細胞破片を分離します。
- 上清を85°Cで15分間加熱します。 95,834 x g で 4 °C で 1 時間スピンダウンします。 上澄み液を回収し、0.45μmフィルターで氷上でろ過します。
- まず、Taq ポリメラーゼバッファー A を使用して Ni-NTA HP 5 mL カラムに 4 mL/分の流速でサンプルを通し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を使用してタンパク質精製を行います(表 2;図1A)。
- 10カラム容量(CV)のTaqポリメラーゼバッファーAと4%のTaqポリメラーゼバッファーBで洗浄します(表2)。100 mLボトルに20 CVを超えるTaqポリメラーゼバッファーBを使用して、線形グラジエントで結合タンパク質を溶出します。
- 100 mL ボトル内の溶離液を、Taq ポリメラーゼバッファー C を使用して、陽イオン交換 5 mL カラムに 4 mL/分で通します(表 2;図1A)。
- 20 CV の 100% Taq ポリメラーゼバッファー C と 5% Taq ポリメラーゼバッファー D で洗浄します(表 2)。
- TaqポリメラーゼバッファーD(表2)を用いて、5%から100%までの直線状グラジエントで溶出します。
- 前述したように、SDS-PAGEゲル電気泳動 39 と続いてゲル染色 40 を行うことにより、溶出画分を確認します。簡単に説明すると、各フラクションを10 μL取り、等量の2x SDSローディング色素を加えます。サンプルを90°Cで10分間変性させます。サンプルを10% SDS-PAGEゲルにロードし、200 Vで25分間ゲルを泳動させ、クマシーブリリアントブルーを使用してゲルを染色し、脱色します。
- 精製したTaqポリメラーゼを含むすべてのフラクションを回収し、Taqポリメラーゼ保存バッファー(表3)に対して4°Cで透析します。 簡単に説明すると、2Lの保存バッファーを調製し、透析カセットをバッファーに2分間浸して水和させます。採取したフラクションをニードルを使用して透析カセットに注入し、攪拌機で200rpmの透析バッファーに一晩放置します。
- 透析後、分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、10μLの分注を行い、液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存する。
注:FPLCシステムにロードする前に、0.45 μmフィルターを使用して精製用のすべてのバッファーをろ過してください。
2. 昆虫細胞発現系におけるMMLV-RT発現と精製
- バクミドDNAの生成と単離
- 前述のように、C末端切断可能なTEV-8xHis-StrepタグでMMLV-RTの配列をクローニングする41。
- 100 ng の発現ベクターを 50 μL の DH10Bac 細胞に混合し、チューブを軽くたたいて穏やかに混合します。
- 細胞を氷上で15分間インキュベートします。セルを42°Cで1分間ヒートショックします。
- 直ちに氷上に移し、400 μLのS.O.C培地を添加します。37°Cで4時間振とうしながらインキュベートします。
- 10μLおよび15μLの混合物を、3つの抗生物質を含むLB寒天プレートにプレートします。50 μg/mL のカナマイシン、10 μg/mL のテトラサイクリン、7 μg/mL のゲンタマイシン、40 μg/mL の IPTG および 100 μg/mL の X-Gal を青白選択用。
- プレートを37°Cで48時間インキュベートします。いくつかの白いコロニーと1つの青いコロニーをコントロールとして選び、上記の抗生物質を含む新鮮なLB寒天プレートにそれらを再ストリークします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
- 白色の表現型を確認したら、いくつかのコロニーを選び、50 mLチューブに50 μg/mLのカナマイシン、10 μg/mLのテトラサイクリン、および7 μg/mLのゲンタマイシンを含む10 mLのLB培地に接種します。
- 培養液を37°Cでインキュベートし、170rpmで一晩振とうします。細胞を22,040 x g で10分間スピンダウンしてペレット化します。
- 上清をデカントし、ミニプレップキットから250 μLの再懸濁液にペレットを再懸濁し(この溶液はメーカーの指示に従って取り扱う必要があります)、溶液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- 250 μLの溶解溶液を加え、穏やかに混合し、3分間インキュベートします。350 μLの中和液を加え、2x-3xを反転させ、22,040 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を新しいチューブに移し、等量の氷冷イソプロパノールを加え、-20°Cで30分間インキュベートします。
- 沈殿したDNAを22,040 x g で10分間スピンしてペレット化します。上清を捨て、700μLの70%氷冷エタノールでペレットを2回洗浄します。
- ペレットに触れずにピペットで上清を取り除きます。ペレットを層流フードで5〜10分間、またはチューブ内に液体が見えなくなるまで風乾させます。ペレットを100μLのEBバッファーに溶解します。
- バクミドトランスフェクションとウイルス増幅
- P1ウイルス調製
- 6ウェル組織培養プレートで、2mLの昆虫細胞培養培地にシード~9 x 105 細胞/ウェルをシードします。
- プレートを室温で~30分間インキュベートし、細胞を接着させます。
- バクミド/フジーンミックスを次のように調製します:1本のチューブに1μgのバクミドDNAと300μLの昆虫細胞培地を混合します。別のチューブで、8 μLのトランスフェクション試薬と300 μLの昆虫細胞培地を混合します。穏やかなピペッティングで両方の混合物を混合し、バクミド/トランスフェクション試薬複合体を形成するまで室温で~30分間放置します。
- バクミド錯体混合物(~210 μL)を各ウェルに滴下し、プレートを透明フィルムで密封します。
- プレートを27°Cで3〜4日間インキュベートします。
- ウイルスを含む培地を採取し、FBS(最終濃度2%)を添加し、0.45μmフィルターでろ過し、P1ウイルスストックとして暗所で4°Cで保存します。
- P2ウイルス製剤
- 培養フラスコに50 mLの昆虫細胞を2 x 106 細胞/mLで3 mLのP1ウイルスをトランスフェクションします。
- 死細胞の割合が25%〜30%に達するまで、100rpmで4〜6日間振とうしながら27°Cでインキュベートします。
- 300 x g で10分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を回収します。
- FBSを最終濃度2%になるように添加し、0.45 μmフィルターでろ過し、それぞれ1 mLを分注し、P2ウイルスストックとして-80°Cで保存します。
- P3ウイルス調製
- 100 mLの昆虫細胞を2 x 106 細胞/mLで培養フラスコに2 mLのP2ウイルスをトランスフェクションします。
- 死細胞の割合が15%〜20%に達するまで、100rpmで3〜4日間振とうしながら27°Cでインキュベートします。
- 細胞を300 x g で10分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を回収します。
- FBSを最終濃度2%に添加します。0.45μmのフィルターでろ過します。4°Cの暗所で1ヶ月間保存できます。
- P1ウイルス調製
- 昆虫細胞におけるMMLV-RTの発現と精製
- 5 mLのP3ウイルスを、合計6フラスコに2 x 106 細胞/mL(700 mL/2Lフラスコ)の密度で新鮮な昆虫細胞に加えます。
- トランスフェクション後55〜60時間、7808 x gで10分間回転させて細胞を回収します。
- 細胞ペレットを200 mLのMMLV-RT溶解バッファーに再懸濁します(表4)。ライセートを 15 kPsi の細胞破壊物質に通し、22,040 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。
- 上清を新しいチューブに移し、95,834 x g 、4°C、1時間スピンダウンします。上澄み液を回収し、0.45μmフィルターで氷上でろ過します。
- まず、MMLV-RTバッファーA(表5)を使用して、サンプルをNi-NTA Excel 5 mLカラム(図1B)に4 mL/minの流速で通すことにより、FPLCを使用したタンパク質精製を開始します。
- 10 CV の MMLV-RT バッファー A と 4% の MMLV-RT バッファー B でカラムを洗浄し(表 5)、100 mL ボトルに MMLV-RT バッファー B の直線グラジエントで 20 CV 以上タンパク質を溶出します。
- 溶出したサンプルを、MMLV-RTバッファーC(表5)で平衡化したStrep 5 mLカラム(図1B)に通します。
- 10 CV の 100% MMLV-RT バッファー C でカラムを洗浄し、20 CV のバッファー D で線形グラジエントでタンパク質を溶出します(表 5)。
- ステップ1.13-1.14と同様にSDS-PAGEを実行して、溶出画分を確認します。精製されたMMLV-RTを含む画分を回収し、4°CでMMLV-RT保存バッファー(表6)に対して透析します。
- ナノドロップ、アリコート、液体窒素中での急速凍結を使用してタンパク質濃度を測定し、-80°Cで保存します。
注:FPLCシステムにロードする前に、0.45 μmフィルターを使用して精製用のすべてのバッファーをろ過してください。
3. 社内マルチプレックスR3TワンステップRT-qPCRキットコンポーネントの準備
- バッファーミックスの調製
- RT-qPCR反応用の2倍バッファーを調製し、その中に37で示した試薬を含みます。すべての試薬をDNase/RNase-Free水で調製し、バッファーミックスを-20°Cの冷凍庫で保存します。
- プライマーおよびプローブセットおよびプライマー混合物の調製
注:使用したプローブとプライマーを 表7に示します。インフルエンザおよびSARS-CoV-2マルチプレックスキットには、3つのプローブと4つのフォワードおよびリバースプライマーセットが含まれています。プローブは、InfAにはレポーター6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、SARS-CoV-2(N遺伝子)にはTexas Red-XN、InfBにはYakima Yellowを使用して5'末端で標識されています。MERS-CoVおよびSARS-CoV-2マルチプレックスキットには、3つのプローブと3つのフォワードおよびリバースプライマーセットが含まれています。また、MERS-CoV(ORF1a遺伝子)にはレポーターTexas Red-XN、MERS-CoV(UpE遺伝子)にはVIC、SARS-CoV-2(N遺伝子)には6-カルボキシフルオレセイン(FAM)のレポーターを使用して、5'末端でプローブを標識します。- 表7にリストされているすべてのプライマーとプローブを含むプライマーミックスを調製し、最終濃度はフォワードプライマーとリバースプライマーごとに6.7 μM、各プローブに1.25 μMです。プライマーミックスは-20°Cの冷凍庫で保管してください。溶出バッファーを使用して、必要な容量を構成します。
- 酵素ミックス調製
- Taqポリメラーゼ(30 U/μL)およびMMLV-RT(60 ng/μL)酵素ミックスを表3に示すようにTaqポリメラーゼ保存バッファーに調製し、必要な容量を調製します。このステップを氷上で行い、酵素ミックスを-20°Cで保存します。
- RNAテンプレート
- SARS-CoV-2、インフルエンザA H1N1、インフルエンザA H3N2、インフルエンザB、MERS-CoVの合成RNAを1x Tris-EDTAバッファー100 μL(10 mM Tri-Clおよび1 mM EDTA(pH 8.0))に別々に再懸濁し、1 x 106 RNAコピー/μLのストックを作成します。
- 1)SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザBを50 μLの容量に各ウイルスストック5 μLを添加し、1 x 105 RNA コピー/μLを作製します。2)SARS-CoV-2、MERS-CoVは、各ウイルスストック5 μLを50 μLの体積に添加して、1 x 105 RNAコピー/μLを1 x 105 RNAコピー /μLから10 RNAコピー/μLの範囲で10倍段階希釈します。
注:テンプレートの段階希釈液を調製するには、必ず氷冷したDNase/RNaseフリーの水を使用してください。
4.社内マルチプレックスSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVワンステップRT-qPCRテスト
注:ワークステーションの表面を消毒し、96ウェルプレートテンプレートを使用してPCRプレートのレイアウトを計画します。
- 96ウェルプレートの調製
- 2xバッファーとプライマーミックスを解凍します。酵素ミックスを氷上に保管してください。
- 各ウェルに、2x バッファーミックス 10 μL、プライマーミックス 1.5 μL、酵素ミックス 1 μL、DNase/RNase-Free Water 6.5 μL、および試験が必要な対応する RNA 混合物 1 μL を加えます。各ウェルの最終容量は20μLです。このステップのヘルプについては、準備されたレイアウトを参照してください。
注:ピペッティングの偏りを避けるために、RNAサンプルを除くすべての試薬を含む反応数に基づいてマスターミックスを作成することをお勧めします。さらに、技術的なエラーを避けるために、反応を二重または三重に実行してください。 - プレートを接着剤PCRプレートシールで密封し、1分間短時間遠心分離して、プレートの底にすべての液体を回収します。サンプルをqPCRマシンに移す前に、各ウェルに同じ量の液体があり、気泡がないことを確認してください。
注:すべてのPCR反応は氷上でセットアップする必要があります。
- PCRプログラム
- リアルタイム qPCR マシンプログラムを開き、以下の実験プロパティを選択します。
ブロックタイプ:Fast 96 ウェル(0.1 mL)
実験のセットアップ:検量線
試薬:TaqMan 試薬
実行プロパティ: 標準。 - すべての遺伝子ターゲットとそのレポーター色素を 表7に示されているように定義します。さらに、増幅曲線の分析を容易にするために、テストする各反応のサンプル名を定義します。
- ターゲットとサンプルを、96ウェルプレートに基づくプログラムのプレートレイアウトに割り当てます。
- PCR装置で以下のサイクルプログラムを以下のように設定します。
55°Cで10分間
40サイクル:94°Cで1分間
94°Cで10秒
68°Cで10秒
68°Cで20秒。ここで蛍光を取得します。 - プレートをリアルタイムqPCRマシンに移し、プレートの正しい向きを確保してホルダーに入れ、分析を開始します。
- 実験データを保存するファイルの場所を選択します。
- リアルタイム qPCR マシンプログラムを開き、以下の実験プロパティを選択します。
- データ解析
- まず、qPCRプログラムによって生成された増幅プロットを調べることが不可欠です。検出限界を分析して、検出可能な最小 RNA 濃度を評価します。
- RNAコピー数の対数をx軸にプロットし、対応する平均Ct値をy軸にプロットして、アッセイの感度を評価します。傾きとR2 は、反応の信頼性と効率を示します。
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Representative Results
近年、PCRアプローチ21、22、23、24、25を使用して一般的な呼吸器ウイルスを検出するための診断アプローチに大きな進歩がありました。しかし、これらの進歩にもかかわらず、1回の検査で複数のウイルスを検出できるマルチプレックスアプローチは、特にRT-qPCRプラットフォームでは広く実装されていません。この方法は、合成RNAウイルスおよび反応成分の社内最適化を用いて成功裏に実施されている37。診断アッセイの特異性、感度、および信頼性は、検出限界分析の使用により高いと評価されました。提示されたアプローチは、呼吸器ウイルス診断の効率と精度を大幅に向上させ、複数の検査の必要性を減らし、43のように誤診のリスクを最小限に抑えることができます。患者サンプルを用いてこのアプローチの利点を探り、臨床診療への採用を促進するには、さらなる研究が必要である。
ヒスチジンタグ付きTaq DNAポリメラーゼの発現と精製
Taq DNAポリメラーゼの発現と精製の確立されたプロトコル44に基づいて、N末端ヒスチジンタグ付きTaq DNAポリメラーゼプラスミドをコールドショックプロモーターの制御下で構築し、上記で説明したように、その発現および精製プロセスを容易にしました(図1Aおよび図2A)。したがって、IPTGの濃度と温度を変えるだけで、この新しい構造の発現レベルを簡単に制御できます。Taq DNAポリメラーゼプラスミドを含む細胞を1 mM IPTGで16°Cでインキュベートすると、His-Taq DNAポリメラーゼの発現が亢進しました。 さらに、以前に確立されたプロトコル44では、時間のかかるポリエチレンイミン(PEI)沈殿ステップが必要でしたが、最終生成物の純度は影響を受けず、市販のTaqポリメラーゼに匹敵するため、ここで使用したコンストラクトでは省略できます(図2B)。 精製されたTaqポリメラーゼは、N末端の酵素とヒスチジンタグの間にリンカーペプチドが存在するため、市販のポリメラーゼよりも移動が遅くなりました。Taq DNAポリメラーゼは、0.98 mg/Lの純粋なタンパク質の大腸菌培養で正常に産生されました。
二重Hisタグおよび連鎖球菌タグ付きMMLV逆転写酵素の発現と精製
バキュロウイルス発現系は、 図2Aに記載されているように、昆虫細胞(Sf9)においてC末端の二重HisおよびStrepタグを有するMMLV-RTを発現するために使用されました。以前の研究では、カイコ-バキュロウイルス発現ベクターシステム(silkworm-BEVS)を利用してカイコでN末端タグタンパク質とC末端タグタンパク質の両方が合成された場合、C末端タグ付きMMLV-RTはより高い活性を示すことが示されました41。均質なMMLV-RTタンパク質を産生するために、上記の研究で提示されたのと同じ戦略とプロトコルが利用されました。その結果、SDS-PAGEゲルの結果 (図2C)が示すように、昆虫細胞培養の収量は7.5 mg/Lで、発現が亢進し、95%以上の純度タンパク質が達成されました。
マルチプレックスqRT-PCRの最適化と標準化
最適化および開発された社内マルチプレックスRT-qPCRテストは、バッファーとプライマーの混合を最適化して、3つの異なる一般的な呼吸器系ウイルスを同時に検出した後、正常に製造されました (図3)37。最初のキットは、SARS-CoV-2 N遺伝子、インフルエンザAのH1N1およびH3N2、およびインフルエンザB遺伝子を標的とするように設計されています。2つ目のキットは、SARS-CoV-2 N遺伝子、MERS ORF1a、およびupE遺伝子用です。したがって、どちらのキットも、ここで紹介するワークフローのように、3つのターゲットすべてを正常に同時に検出できます (図3)。 このプロトコルで使用された各ウイルスの合成RNAサンプルは、一般的な呼吸器系ウイルスの検出にマルチプレックスキットなどを使用する可能性を示しました。この診断テストの感度は、患者サンプルで以前に報告された結果と同様です。.患者がインフルエンザ様症状を示す場合、マルチプレックスリアルタイムRT-qPCRの使用は、SARS-CoV-2、インフルエンザAおよびインフルエンザBマルチプレックスアッセイと同等の結果を示している45。
一般的な呼吸器系ウイルスに対する社内マルチプレックスRT-qPCRキットの感度と検出限界
社内マルチプレックスキットの有効性は、マルチプレックスRT-qPCRワークフロー(図3)に示されているように、2セットのプライマーミックスと各キットに対応する合成RNAを使用して評価しました。10 から 105 コピー/μL の範囲の各合成 RNA ミックスを 10 倍段階希釈した各プライマーミックスをテンプレートとして使用し、開発されたマルチプレックス RT-qPCR の両方の感度、特異性、および検出限界を検量線分析を使用して決定できます。これは、マルチプレックスRT-qPCRキットの有効性と一貫性を確認するために、各テストの3つの独立した繰り返しで行われます。その結果、今回開発した2つのキットは、増幅曲線と検出限界(LoD)からわかるように、わずか10個のRNAコピー/反応で3つの標的遺伝子すべてを同時に増幅することに成功しました(図4および図5)。各曲線の傾きと R2 値を使用して、個々のアッセイの効率を評価しました(図 4 および 図 5)。R2 値は、データ点への線形近似の良さの推定値を提供しました。効率的なqPCRアッセイでは、R2は0.90に非常に近いか、0.90より大きくなければなりません。インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、またはMERS-CoVとSARS-CoV-2の滴定の増幅効率は、すべてのプライマーセットで99%を超えました(図4および図5)。さらに、小さなエラーバーは、マルチプレックス化された各RT-qPCRキットの再現性を証明しています。ネガティブコントロールでは増幅がないため、両方のマルチプレックスキットはプライマー二量体形成を示さなかったことに注意することが重要です(データは示していません)。したがって、両方のキットの設計により、信頼性、特異性、および感度ですべての標的遺伝子を正常に増幅しました。
図1:マルチプレックスワンステップRT-qPCRキットアセンブリの概略図。 キットの組み立ては、必要な酵素、Taq DNAポリメラーゼおよびMMLV逆転写酵素の発現と精製から始まります。図のように、両方の酵素を2つのカラムに通す必要がありました。第二に、精製に続いて、反応条件と熱サイクルプログラムの最適化が行われ、マルチプレックステストキットの最適な条件が得られました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:His-Taq PolおよびC-His/Strep MMLV-RTのプラスミドコンストラクトと精製結果。 (A)組換えHis-Taq PolおよびC-His/Strep MMLV-RT発現プラスミドの模式図。略語:CSPAプロモーター - コールドショックプロテインAプロモーター;RBS - リボソーム結合部位。6x His - 6つのヒスチジンを含むHisタグ。TEE - 並進増強要素。Taq ORF - Taq PolオープンリーディングフレームPolh - ポリヘドリンプロモーター;MMLV-RT ORF - MMLV-RT オープンリーディングフレーム。TEV - エッチングウイルスプロテアーゼ標的部位;8x His - 8つのヒスチジンを含むHisタグ。連鎖球菌 - 連鎖球菌タグ;polyA - SV40後期ポリアデニル化シグナル。(B)BL21(DE3) 大腸菌 細胞に発現したHis-Taq PolとTaqポリメラーゼのSDS-PAGE分析。(C)Sf9細胞で発現した精製C-His/Strep MMLV-RTのSDS-PAGE分析。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:最適化、標準化、開発された2つのマルチプレックスワンステップRT-qPCRキットと反応成分の概略図。 各マルチプレックス反応は、dNTP、バッファーミックス、酵素ミックス、マルチプレックスプライマーミックス、および試験対象の合成RNAテンプレートで構成されています。(A)インフルエンザA/B、SARS-CoV-2キットおよび(B)MERS ORF1a/upE、SARS-CoV-2。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:インフルエンザA/BおよびSARS-CoV2マルチプレックスワンステップRT-qPCRキットの増幅曲線と検出限界。マルチプレックスRT-qPCRの増幅曲線は、すべてのターゲット(A)インフルエンザA、(C)インフルエンザB、および(E)SARS-CoV-2で、10倍段階希釈(10〜105コピー/μL)の合成RNA混合物を使用して行いました。反応は3回に分けて行い、1回の繰り返しを例に示しました。(B)インフルエンザA、(D)インフルエンザB、(F)SARS-CoV-2の検出限界は、3つの反復Ct値の平均をログコピー数に対してプロットすることによって決定されました。決定係数(R2)と線形回帰曲線の式を計算し、各パネルに示した。エラーバーは、3つの反復間の標準偏差を表します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:MERS ORF1a/upEおよびSARS-CoV2マルチプレックスワンステップRT-qPCRキットの増幅曲線と検出限界。マルチプレックスRT-qPCRの増幅曲線は、すべてのターゲット(A)MERS ORF1a、(C)MERS upE、および(E)SARS-Cov-2を含む10倍段階希釈(10〜105コピー/μL)の合成RNA混合物を使用して行いました。反応は3回に分けて行い、1回の繰り返しを例に示しました。(B)MERS ORF1a、(D)MERS upE、および(F)SARS-CoV-2の検出限界は、ログコピー数に対して3つの複製されたCt値の平均をプロットすることによって決定されました。決定係数(R2)と線形回帰曲線の式を計算し、各パネルに示した。エラーバーは、3つの反復間の標準偏差を表します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1: Taqポリメラーゼ溶解バッファーの成分リスト。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:Taqポリメラーゼ精製バッファー。 Taq DNA ポリメラーゼの 2 カラム精製に必要なバッファー成分のリストです。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:Taqポリメラーゼ保存バッファー。 精製後のTaq DNAポリメラーゼの透析に必要なバッファー成分のリストです。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4: MMLV-RT溶解バッファーの成分リスト。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表5:MMLV-RT精製バッファー。 MMLV-RTの2カラム精製に必要なバッファー成分のリストです。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 6:MMLV-RT ストレージ バッファ 精製後のMMLV-RTの透析に必要な緩衝成分のリスト。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表7:プライマーとプローブの情報。 マルチプレックスされた各プライマーミックスに必要なプライマーおよびプローブの配列情報。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoV変異株などの一般的な呼吸器系ウイルスの蔓延による高い感染率と死亡率により、世界中の医療システムに大きな経済的負担がかかっています12,19,20。この負担を軽減する責任感に突き動かされ、1回の検査でこれらの一般的なウイルスを区別するためのRT-qPCRなどの迅速で正確でアクセスしやすい診断アッセイの必要性に気づきました。qRT-PCRのマルチプレックス性により、SARS-CoV-2を診断し、インフルエンザA/BウイルスやMERS-CoVウイルスなどの他の呼吸器系ウイルスと区別することができます。究極的には、患者のより優れた、より正確な治療が、本多重アッセイ46を用いて達成され得る。要約すると、この研究は、2つの異なる組み合わせをターゲットにできる社内のワンステップマルチプレックスRT-qPCRテストの実現について説明します。それぞれの組み合わせは、このような感染性ウイルスの蔓延を制限し、医療システムの経済的負担を軽減するために、3つの異なる呼吸器ウイルスで構成されています。
現在のマルチプレックスRT-qPCRキットは、一般的な呼吸器系ウイルス(SARS-CoV-2、インフルエンザA/B)と(SARS-CoV-2、MERS UpE/ORF1a)の2つの組み合わせを標的とすることができます。記載されているプロトコルは、市販のワンステップRT-qPCRキットよりもはるかに安価で、簡単で従うことができます。もう一つの利点は、異なるプローブとプライマーの組み合わせを利用して、複数のウイルス遺伝子標的を標的にできるキットの多重化特性でした。したがって、キットの汎用性とシンプルさにより、リソースが限られている設定でも簡単に実装できます。また、このキットは広範な検査に適しており、複数の呼吸器系ウイルスの拡散や同時感染を抑えるのに役立つ正確で精密な診断が可能です。
予備アッセイを実施して、すべてのターゲットが正常に増幅され、非特異的産物の形成を制限するために高い忠実度で増幅されたことを確認しました。まず、バッファーミックスの成分とバッファーミックス中のそれぞれの濃度について、数回の最適化を行いました。次に、プライマーミックスとPCR反応の両方において、プライマーとそれに対応する濃度を最適化しました。第三に、酵素ミックスの組成を最適化して、その活性を最大化し、Taqポリメラーゼ47の活性に対するMMLV-RTの阻害効果を最小限に抑えました。第4に、両酵素の熱安定性の限界を考慮して、熱サイクル条件を最適化しました。前述の改良を組み込んだ、今回紹介するマルチプレックスRT-qPCRキットの最適化バージョンは、高い特異性、感度、再現性で最大10個のRNAコピー/反応を検出することができました。
マルチプレックスRT-qPCRアッセイの高効率と成功裏の実施を確実にし、阻害剤を防止し、ピペッティングエラーを回避するために、いくつかの予防措置を考慮する必要があります。各施設はセットアップと機器に固有のため、そのようなキットを構築する際に役立つ可能性のあるいくつかの手順を次に示します。 まず、汚染やPCR阻害剤の存在を避けるために、常に手袋を着用する必要があります。次に、エアロゾル耐性のあるフィルターチップを使用し、校正済みのピペットを使用してください。また、必ずPCRグレードの水を使用してください。テンプレートなしのコントロールを使用すると、汚染の存在を確認するのに役立ちます。マスターミックスは、コンタミネーションやピペッティングのばらつきを避けるために、すべての繰り返しに対して調製する必要があることに注意することが重要です。プローブの品質を維持するためには、ストックの分注や希釈のための水の使用を避けるなど、その他のトラブルシューティングのヒントを考慮する必要があります。使用するプライマーとプローブの保管と希釈に関するメーカーの推奨事項に従うことが重要です。したがって、これらの簡単なヒントは、マルチプレックスRT-qPCRアッセイの成功を維持し、その高効率を確保するのに役立ちます。
本研究で開発されたマルチプレックスRT-qPCRアッセイは、合成ウイルスRNAで試験したところ良好な結果が得られていますが、実際の臨床現場での有効性はまだ評価および検証が必要です。残念ながら、臨床検体が不足しているため、この調査に含まれるウイルスに対するアッセイの特異性と感度を決定することは困難です。ただし、サンプルの100%で検出できるコピーの最小数を示すLOD(検出限界)は、統計的に証明された線形回帰によって確立されたことに言及する価値があります。これは臨床診断の可能性を提供し、研究の重要な発見です。
この試験では、プローブベースの社内マルチプレックスワンステップRT-qPCRアッセイの開発と検証に成功し、高い有効性を示しました。SARS-CoV-2は、上記で説明したように、1本の試験管で高い効率と信頼性で簡単に検出し、他の一般的な呼吸器系ウイルスと区別することができます。したがって、このマルチプレックス機能への依存は、他の検査アプローチやシングルプレックスPCRと比較して、診断のスループットを向上させ、時間、コスト、およびサンプルを節約するのに役立ちます。全体として、呼吸器系ウイルスが一緒に循環する可能性が高く、このマルチプレックスワンステップRT-qPCRは非常に有利です。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、キング・アブドゥッラー科学技術大学(King Abdullah University of Science and Technology)が中核資金とS.M.H.へのNational Term Grand Challenge(NTGC)を通じて支援しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
| 6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
| Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
| FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
| Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
| Protein marker | Fermentas | 26616 | |
| RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
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