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Biology

Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

Abstract

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una grave amenaza para la salud pública en general. Durante las temporadas de influenza, la propagación del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios puede causar una carga de enfermedades respiratorias en toda la población que es difícil de manejar. Para ello, los virus respiratorios SARS-CoV-2, gripe A, gripe B y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) deberán vigilarse cuidadosamente en las próximas temporadas de otoño e invierno, especialmente en el caso del SARS-CoV-2, la gripe A y la gripe B, que comparten factores epidemiológicos similares como las poblaciones susceptibles, el modo de transmisión y los síndromes clínicos. Sin ensayos específicos de objetivos, puede ser difícil diferenciar entre los casos de estos virus debido a sus similitudes. En consecuencia, un ensayo múltiple sensible y dirigido que pueda diferenciar fácilmente entre estas dianas virales será útil para los profesionales sanitarios. En este estudio, desarrollamos un ensayo basado en PCR con transcriptasa inversa en tiempo real utilizando un kit de RT-qPCR de un solo paso R3T desarrollado internamente para la detección simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con tan solo 10 copias de sus ARN sintéticos, podemos identificar con éxito los objetivos del SARS-CoV-2, la gripe A, la gripe B y el MERS-CoV simultáneamente con un 100% de especificidad. Se ha comprobado que este ensayo es preciso, fiable, sencillo, sensible y específico. El método desarrollado se puede utilizar como un ensayo de diagnóstico optimizado para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV en hospitales, centros médicos y laboratorios de diagnóstico, así como con fines de investigación.

Introduction

La pandemia de la actual enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) está causada por el nuevo coronavirus conocido como coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)1. Debido a la fuerte contagiosidad del SAR-CoV-2 y a su capacidad de transmisión rápida, la pandemia de COVID-19 surgió en la ciudad de Wuhan, China, y se propagó rápidamente por todo el mundo. Con el tiempo, esto condujo al inicio de signos de dificultad respiratoria e incluso a la muerte 2,3,4. La COVID-19 ha sido declarada pandemia en más de 213 países, previéndose un fuerte aumento en el número de casos confirmados, como lo demuestran los trabajos publicados por diferentes estudios de investigación 3,5. El COVID-19 se transmite principalmente por pequeñas gotitas respiratorias que las personas infectadas liberan al medio ambiente y luego se exponen a las personas vulnerables a través de la inhalación o el contacto cercano con superficies contaminadas. Cuando estas gotitas entran en contacto con la mucosa de los ojos, la boca o la nariz, una persona puede infectarse6. Las estadísticas publicadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) muestran que ha habido más de 76 millones de casos confirmados de la pandemia en todo el mundo, con la asombrosa cifra de 7 millones de muertes7. Así, las Naciones Unidas clasificaron la pandemia causada por la enfermedad COVID-19 como un desastre debido a su impacto directo en la vida de miles de millones de personas en todo el mundo y tuvo efectos económicos, ambientales y sociales de gran alcance.

Se ha demostrado que las iniciativas de salud pública, incluidas las pruebas exhaustivas, la detección temprana, el rastreo de contactos y el aislamiento de casos, son cruciales para mantener esta pandemia bajo control 8,9,10,11. Los meses de invierno aumentarán la circulación de otros virus respiratorios como la influenza A y B con síntomas similares a los de COVID-19, lo que dificultará la identificación, el seguimiento y el aislamiento temprano de los casos de COVID-19. Cada año, el brote de influenza A y B comienza a fines del otoño o principios de enero con una estacionalidad predecible12. Numerosos rasgos epidemiológicos son compartidos por los virus SARS-CoV-2 y Influenza. Además, comparte similitudes en las poblaciones susceptibles, que incluyen niños, ancianos, inmunodeprimidos e individuos con comorbilidades crónicas como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardíaca y renal o diabetes12,13. Estos virus no solo comparten poblaciones vulnerables, sino también vías de transmisión de contacto y gotitas respiratorias14. Se anticipa que es probable que los pacientes contraigan más de uno de estos virus respiratorios a medida que se acerca la temporada de influenza14. Para ello, es necesario realizar el cribado del SARS-CoV-2 y de los virus de la gripe en pacientes sintomáticos antes de aislarlos. No es posible realizar pruebas separadas para los tres virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) debido a la falta mundial de recursos para la extracción y el diagnóstico de ácidos nucleicos. Con el fin de examinarlos todos en una sola reacción, es necesario desarrollar un método o prueba.

El síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV es un miembro de la familia del coronavirus humano (CoV). Las primeras cepas aisladas del virus MERS-CoV procedían de un paciente hospitalizado en Arabia Saudí que había fallecido en septiembre de 2012 debido a problemas respiratorios agudos15. Hay pruebas que sugieren que un huésped importante del MERS-CoV son los dromedarios. Se ha comprobado que los virus de dromedarios infectados son zoonóticos y, por lo tanto, pueden infectar a los humanos16,17. Los seres humanos infectados con este virus pueden transmitirlo a otras personas a través del contacto cercano18. Hasta el 26 de enero de 2018, se habían registrado 2143 casos de infección por MERS-CoV confirmados mediante pruebas de laboratorio, incluidas 750 muertes en todo elmundo. Los síntomas más típicos del MERS-CoV son tos, fiebre y dificultad para respirar. También se ha notificado que las infecciones por MERS-CoV presentan síntomas de neumonía, diarrea y enfermedades gastrointestinales20. En la actualidad, no se dispone de una vacuna comercial ni de un tratamiento específico para el MERS-CoV. Por lo tanto, el diagnóstico rápido y preciso es esencial para prevenir los brotes generalizados de MERS-CoV y diferenciar el MERS-CoV de la enfermedad por SARS-CoV-2.

Hasta la fecha, se han propuesto muchos enfoques para detectar estos virus, como la RT-PCRmultiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 y CRISPR/Cas329, inmunoensayo de flujo lateral30, sensores biomoleculares en papel31, pruebas SHERLOCK en un bote32, aptámero de ADN33, isoterma mediada por bucle amplificación (LAMP)19,34, etc. Cada uno de los métodos mencionados anteriormente tiene ventajas e inconvenientes únicos en términos de sensibilidad y especificidad. Entre estos métodos, la prueba basada en la amplificación de ácidos nucleicos: qRT-PCR multiplex, es la más común y se considera el estándar de oro para el diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B y MERS-CoV.

En este estudio, diseñamos y evaluamos varias combinaciones de cebadores y sondas para la detección efectiva, precisa y simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando ARN virales sintéticos de torsión estándar. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda los ensayos multiplexados desarrollados para los genes diana del MERS-CoV o del SARS-CoV-2. Por lo general, estos genes codifican proteínas y complejos que contribuyen a la formación de un complejo de replicación/transcripción (RTC)35, como la región dentro del marco de lectura abierto 1a (ORF1a) que se utiliza para el ensayo del MERS-CoV. Además, las proteínas estructurales están codificadas por los genes utilizados en los ensayos de diagnóstico, como la región ascendente del gen de la envoltura (upE) y el gen de la nucleocápside (N), que se utilizan para los ensayos de MERS-CoV y SARS-Cov-2, respectivamente35,36. Utilizamos el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T para establecer la RT-qPCR para la detección de virus37. La detección de virus, la sensibilidad, la especificidad y el rango dinámico de nuestro kit de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores se probaron y evaluaron utilizando diluciones en serie de 10 veces de los ARN sintéticos de torsión estándar. El límite de detección práctico más bajo fue de aproximadamente 10 copias de transcripción por reacción. Como resultado, el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores/sondas se pueden utilizar e implementar con éxito para el diagnóstico simultáneo rutinario de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV.

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Protocol

1. Expresión y purificación de la polimerasa Taq

  1. Construya un plásmido con una etiqueta de hexa-histidina escindible en el extremo C de la enzima.
  2. Transformar 50 ng del vector de expresión en cepa BL21-(DE3) de E. coli siguiendo el protocolo estándar38.
  3. Inocular las células transformadas en cuatro matraces de 6 L, cada uno de los cuales contiene 2 L de caldo de 2YT a 37 °C con agitación a 170 rpm hasta alcanzar el OD 600 de 0,8 o el número de celda 6,4 x 108 .
  4. Inducir la expresión de la polimerasa Taq con 0,5 mM de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar a 16 °C durante 18 h con agitación.
  5. Coseche las células girándolas a 4 °C a 7808 x g durante 10 min. Resuspender los gránulos en 200 ml de un tampón de lisis de polimerasa Taq helado (Tabla 1) en 5 ml/g de gránulos celulares.
  6. Incubar las células con lisozima (2 mg/ml de tampón de lisis) e inhibidores de la proteasa durante 45 min y luego pasar el lisado a través de un disruptor celular a 30 kPsi y centrifugar a 22.040 x g durante 30 min a 4 °C para separar los restos celulares.
  7. Calentar el sobrenadante durante 15 min a 85 °C. Centrifugar a 95.834 x g durante 1 h a 4 °C. Recoja el sobrenadante y fíltrelo en hielo con un filtro de 0,45 μm.
  8. Realice la purificación de proteínas mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) pasando primero la muestra a través de una columna de Ni-NTA HP de 5 ml a un caudal de 4 ml/min utilizando el tampón de polimerasa Taq A (Tabla 2; Figura 1A).
  9. Lavar con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de polimerasa Taq A y 4% de tampón de polimerasa B de Taq (Tabla 2). Eluir la proteína unida con un gradiente lineal utilizando el tampón B de la polimerasa Taq durante 20 CV en un frasco de 100 ml.
  10. Pasar el eluyente en el frasco de 100 mL a través de una columna de intercambio catiónico de 5 mL a 4 mL/min utilizando el tampón de polimerasa Taq C (Tabla 2; Figura 1A).
  11. Lavar con 20 CV de tampón de polimerasa Taq C al 100% y tampón polimerasa D de Taq al 5% (Tabla 2).
  12. Eluir con un gradiente lineal utilizando el tampón de polimerasa Taq D (Tabla 2) a partir del 5% al 100%.
  13. Compruebe las fracciones eluidas realizando la electroforesis en gel SDS-PAGE 39 seguida de la tinción en gel 40 como se ha descrito anteriormente. Brevemente, tome 10 μL de cada fracción y agregue un volumen igual de 2x SDS de tinte de carga. Desnaturalizar la muestra a 90°C durante 10 min. Cargue las muestras en un gel SDS-PAGE al 10% y deje pasar el gel durante 25 minutos a 200 V. Tiña el gel con Coomassie Brilliant Blue y luego quita las manchas.
  14. Recoger todas las fracciones que contienen la polimerasa Taq purificada y dializarlas contra el tampón de almacenamiento de la polimerasa taq (Tabla 3) a 4 °C. Brevemente, prepare 2 L del tampón de almacenamiento y sumerja el casete de diálisis en el tampón durante 2 minutos para hidratarse. Inyecte las fracciones recogidas con una aguja en el casete de diálisis y déjelo toda la noche en el tampón de diálisis a 200 rpm en el agitador.
  15. Después de la diálisis, medir la concentración de proteínas con un espectrofotómetro, hacer alícuotas de 10 μL, congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
    NOTA: Filtre todos los tampones para la purificación utilizando un filtro de 0,45 μm antes de cargarlos en el sistema FPLC.

2. Expresión de MMLV-RT en el sistema de expresión y purificación de células de insectos

  1. Generación y aislamiento de ADN de Bacmid
    1. Clone la secuencia de MMLV-RT con una etiqueta TEV-8xHis-Strep escindible en el extremo C-terminal como se describió anteriormente41.
    2. Mezcle 100 ng del vector de expresión en 50 μL de células DH10Bac y mezcle suavemente golpeando el tubo.
    3. Incubar las células en hielo durante 15 min. Realice un choque térmico en las celdas durante 1 minuto a 42 °C.
    4. Transfiera inmediatamente a hielo y agregue 400 μL de medio S.O.C. Incubar a 37 °C con agitación durante 4 h.
    5. Placa de 10 μL y 15 μL de la mezcla en placas de agar LB que contienen tres antibióticos; 50 μg/mL de Kanamicina, 10 μg/mL de Tetraciclina y 7 μg/mL de Gentamicina junto con 40 μg/mL de IPTG y 100 μg/mL de X-Gal para la selección azul-blanca.
    6. Incubar las placas a 37 °C durante 48 h. Escoja varias colonias blancas y una colonia azul como control, y vuelva a colocarlas en placas frescas de agar LB que contengan los antibióticos anteriores. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
    7. Después de confirmar el fenotipo blanco, elija un par de colonias e inocule en 10 ml de medio LB que contenga 50 μg/ml de kanamicina, 10 μg/ml de tetraciclina y 7 μg/ml de gentamicina en tubos de 50 ml.
    8. Incubar el cultivo a 37 °C agitando a 170 rpm durante la noche. Pulveriza las células haciéndolas girar a 22.040 x g durante 10 min.
    9. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 250 μL de solución de resuspensión del kit de minipreparación (esta solución debe manipularse de acuerdo con las instrucciones del fabricante), luego transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    10. Añadir 250 μL de solución de lisis, mezclar suavemente e incubar durante 3 min. Añadir 350 μL de solución neutralizante, invertir 2x-3x y centrifugar a 22.040 x g durante 10 min.
    11. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y añadir un volumen igual de isopropanol helado e incubar durante 30 min a -20 °C.
    12. Pulverizar el ADN precipitado girando a 22.040 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 700 μL de etanol helado al 70%, 2x.
    13. Retire el sobrenadante con una pipeta sin tocar el gránulo. Deje que el pellet se seque al aire en la campana de flujo laminar durante 5-10 minutos o hasta que no se vea líquido en el tubo. Disolver el gránulo en 100 μL de tampón EB.
  2. Transfección de Bacmid y amplificación del virus
    1. Preparación del virus P1
      1. En una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, siembre ~ 9 x 105 células/pocillo en 2 mL de medio de cultivo de células de insectos.
      2. Incube la placa durante ~ 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se adhieran.
      3. Prepare la mezcla de Bacmid/Fugene de la siguiente manera: mezcle 1 μg de ADN de Bacmid y 300 μL de medios de células de insectos en un tubo. En otro tubo, mezcle 8 μL de reactivo de transfección y 300 μL de medios de células de insecto. Mezclar ambas mezclas mediante un pipeteo suave y dejar reposar ~30 min a temperatura ambiente para que se forme el complejo de reactivos de bacmid/transfección.
      4. Agregue la mezcla de complejo de bacmid (~ 210 μL) a cada pocillo gota a gota y selle la placa con una película transparente.
      5. Incubar la placa a 27 °C durante 3-4 días.
      6. Tome el medio que contiene el virus, agregue FBS (concentración final 2%), filtre con un filtro de 0,45 μm y almacene a 4 ° C en la oscuridad como stock de virus P1.
    2. Preparación del virus P2
      1. Transfectar 50 mL de células de insecto a 2 x 106 células/mL con 3 mL de virus P1 en un matraz de cultivo.
      2. Incubar a 27 °C con agitación a 100 rpm durante 4-6 días hasta que el porcentaje de células muertas alcance el 25%-30%.
      3. Centrifugar a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus.
      4. Añadir FBS hasta una concentración final del 2%, filtrar a través de un filtro de 0,45 μm y alícuotas de 1 ml cada uno y almacenar a -80 °C como caldo de virus P2.
    3. Preparación del virus P3
      1. Transfectar 100 mL de células de insecto a 2 x 106 células/mL con los 2 mL de virus P2 en un matraz de cultivo.
      2. Incubar a 27 °C con agitación a 100 rpm durante 3-4 días hasta que el porcentaje de células muertas alcance el 15%-20%.
      3. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus.
      4. Agregue FBS a una concentración final del 2%. Filtrar a través de un filtro de 0,45 μm. Se puede almacenar en la oscuridad a 4 °C durante 1 mes.
  3. Expresión y purificación de MMLV-RT en células de insectos
    1. Añadir 5 ml de virus P3 a las células frescas de insectos a una densidad de 2 x 106 células/ml (matraz de 700 ml/2 litros) en un total de 6 frascos.
    2. Cosechar las células después de 55-60 h de post-transfección girando a 7808 x g durante 10 min.
    3. Resuspender los gránulos celulares en 200 mL de tampón de lisis MMLV-RT (Tabla 4). Pasar el lisado a través de un disruptor celular a 15 kPsi y centrifugar a 22.040 x g durante 30 min a 4 °C.
    4. Trasvasar el sobrenadante a nuevos tubos y volver a centrifugar a 95,834 x g a 4 °C durante 1 h. Recoja el sobrenadante y fíltrelo en hielo con un filtro de 0,45 μm.
    5. Comience la purificación de proteínas mediante FPLC pasando primero la muestra a través de la columna de 5 ml de Ni-NTA Excel (Figura 1B) a un caudal de 4 ml/min utilizando el tampón A de MMLV-RT (Tabla 5).
    6. Lavar la columna con 10 CV de tampón MMLV-RT A y 4% de tampón MMLV-RT B (Tabla 5) y eluir la proteína con el gradiente lineal de tampón MMLV-RT B durante 20 CV en un frasco de 100 mL.
    7. Pasar la muestra eluida a través de la columna de estreptococo 5 mL (Figura 1B) equilibrada con el tampón MMLV-RT C (Tabla 5).
    8. Lavar la columna con 10 CV de tampón C MMLV-RT al 100% y eluir la proteína con un gradiente lineal con 20 CV de tampón D (Tabla 5).
    9. Verifique las fracciones eluidas realizando SDS-PAGE como se hace en los pasos 1.13.-1.14. y recoger las fracciones que contienen MMLV-RT purificado para dializarlas con el tampón de almacenamiento de MMLV-RT (Tabla 6) a 4 °C.
    10. Mida la concentración de proteínas con Nanodrop, alícuota, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C.
      NOTA: Filtre todos los tampones para la purificación utilizando un filtro de 0,45 μm antes de cargarlos en el sistema FPLC.

3. Preparación de componentes internos del kit RT-qPCR de un solo paso R3T multiplex

  1. Preparación de la mezcla tampón
    1. Prepare el tampón 2x para la reacción RT-qPCR que contiene los reactivos mostrados anteriormente en elpunto 37. Preparar todos los reactivos en agua sin DNasa/RNasa y la mezcla tampón almacenada en un congelador a -20 °C.
  2. Preparación de la mezcla de cebadores y sondas y cebadores
    NOTA: Las sondas y cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 7. El kit multiplexado contra la influenza y el SARS-CoV-2 contiene 3 sondas y 4 juegos de cebadores hacia adelante y hacia atrás. Las sondas se marcan en los extremos 5′ utilizando reporteros 6-carboxifluoresceína (FAM) para InfA, Texas Red-XN para SARS-CoV-2 (gen N) y Yakima Yellow para InfB. El kit multiplexado para el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 contiene 3 sondas y 3 juegos de cebadores directos e inversos. Las sondas también se marcan en los extremos 5′ utilizando reporteros Texas Red-XN para MERS-CoV (gen ORF1a), VIC para MERS-CoV (gen UpE) y 6-carboxifluoresceína (FAM) SARS-CoV-2 (gen N).
    1. Prepare una mezcla de cebadores que contenga todos los cebadores y sondas enumerados en la Tabla 7 con una concentración final de 6,7 μM para cada cebador directo e inverso y 1,25 μM para cada sonda en un tubo de 1,5 mL. Guarde la mezcla de imprimación en el congelador a -20 °C. Utilice el tampón de elución para compensar el volumen requerido.
  3. Preparación de la mezcla de enzimas
    1. Prepare la mezcla de enzimas Taq polimerasa (30 U/μL) y MMLV-RT (60 ng/μL) en el tampón de almacenamiento de la polimerasa Taq como se muestra en la Tabla 3 para completar el volumen requerido. Realice este paso en hielo y almacene la mezcla de enzimas a -20 °C.
  4. Plantilla de ARN
    1. Resuspender los ARN sintéticos del SARS-CoV-2, la gripe A H1N1, la gripe A H3N2, la gripe B y el MERS-CoV por separado en 100 μl de 1 tampón Tris-EDTA (10 mM de Tri-Cl y 1 mM de EDTA (pH 8,0) para obtener un stock de 1 x 106 6 copias de ARN/μL.
    2. Mezclar ARN sintéticos para RT-qPCR en las siguientes configuraciones: 1) SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B agregando 5 μL de cada stock de virus a un volumen de 50 μL para hacer 1 x 105 copias de ARN/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV añadiendo 5 μL de cada stock de virus a un volumen de 50 μL para hacer 1 x 105 copias de ARN/μL. Hacer diluciones seriadas 10 veces de cada mezcla de ARN sintético que van desde 1 x 105 copias de ARN/μL hasta 10 copias de ARN/μL.
      NOTA: Asegúrese de utilizar agua helada sin DNasa/RNasa para preparar la dilución en serie de las plantillas.

4. Prueba de RT-qPCR de un solo paso para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV multiplexada internamente

NOTA: Desinfecte las superficies de la estación de trabajo y utilice una plantilla de placa de 96 pocillos para planificar el diseño de la placa de PCR.

  1. Preparación de la placa de 96 pocillos
    1. Descongele 2 veces la mezcla de tampón e imprimación. Mantenga la mezcla de enzimas en hielo.
    2. A cada pocillo, agregue 10 μL de mezcla tampón 2x, 1,5 μL de la mezcla de cebadores, 1 μL de mezcla de enzimas, 6,5 μL de agua libre de DNasa/RNasa y 1 μL de la mezcla de ARN correspondiente que debe analizarse. El volumen final en cada pocillo es de 20 μL. Consulte el diseño preparado para obtener ayuda con este paso.
      NOTA: Se recomienda hacer una mezcla maestra basada en el número de reacciones que contienen todos los reactivos excepto la muestra de ARN para evitar el sesgo de pipeteo. Además, realiza las reacciones por duplicado o triplicado para evitar errores técnicos.
    3. Selle la placa con un sello adhesivo de placa PCR y centrifugue brevemente durante 1 minuto para recoger todo el líquido en el fondo de la placa. Asegúrese de que cada pocillo tenga el mismo volumen de líquido y esté libre de burbujas antes de transferir las muestras a la máquina de qPCR.
      NOTA: Todas las reacciones de PCR deben configurarse en hielo.
  2. Programa de PCR
    1. Abra el programa de máquina de qPCR en tiempo real y elija las siguientes propiedades experimentales:
      El tipo de bloque: Rápido de 96 pocillos (0,1 ml)
      Configuración del experimento: Curva estándar
      Reactivos: Reactivos TaqMan
      Propiedades de ejecución: Estándar.
    2. Defina todas las dianas génicas y su colorante reportero como se presenta en la Tabla 7. Además, defina los nombres de las muestras para cada reacción que se va a probar para facilitar el análisis de las curvas de amplificación.
    3. Asigne objetivos y muestras al diseño de la placa del programa en función de la placa de 96 pocillos.
    4. Configure el siguiente programa de ciclo en el instrumento de PCR de la siguiente manera:
      55 °C durante 10 min
      40 ciclos: 94 °C durante 1 min
      94 °C durante 10 s
      68 °C durante 10 s
      68 °C durante 20 s; Aquí adquieren fluorescencia.
    5. Transfiera la placa a la máquina de qPCR en tiempo real y colóquela en el soporte asegurando la correcta orientación de la placa e inicie la corrida.
    6. Elija la ubicación del archivo para guardar los datos experimentales.
  3. Análisis de datos
    1. Es esencial examinar primero los gráficos de amplificación producidos por el programa qPCR. Analizar el límite de detección para evaluar la concentración mínima de ARN que se puede detectar.
    2. Grafique el logaritmo del número de copias de ARN en el eje x y el valor medio de Ct correspondiente en el eje y para evaluar la sensibilidad del ensayo. La pendiente y la R2 indican la fiabilidad y eficiencia de la reacción.

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Representative Results

En los últimos años, se han producido avances significativos en el abordaje diagnóstico para la detección de virus respiratorios comunes mediante abordajes de PCR 21,22,23,24,25. Sin embargo, a pesar de estos avances, el enfoque multiplexado, que permite detectar múltiples virus en una sola prueba, no se ha implementado ampliamente, particularmente en la plataforma RT-qPCR. Este método se ha implementado con éxito utilizando virus de ARN sintéticos y optimizando internamente los componentes de la reacción37. Se evaluó que la especificidad, sensibilidad y confiabilidad del ensayo diagnóstico eran altas, mediante el uso de un análisis de límite de detección. El enfoque presentado podría mejorar en gran medida la eficiencia y la precisión del diagnóstico de virus respiratorios, reduciendo la necesidad de múltiples pruebas y minimizando el riesgo de diagnóstico erróneo como en43. Se necesita más investigación para explorar los beneficios de este enfoque utilizando muestras de pacientes y fomentar su adopción en la práctica clínica.

Expresión y purificación de la ADN polimerasa Taq marcada con histidina
Sobre la base del protocolo establecido de expresión y purificación de la ADN polimerasaTaq 44, se construyó un plásmido de ADN polimerasa Taq marcado con histidina N-terminal bajo el control de un promotor de choque frío para facilitar su proceso de expresión y purificación como se explicó anteriormente (Figuras 1A y Figura 2A). Por lo tanto, con solo alterar la concentración y la temperatura de IPTG, el nivel de expresión de esta nueva construcción se puede controlar fácilmente. La incubación de células que contenían el plásmido ADN polimerasa Taq a 16 °C con 1 mM de IPTG mostró una mayor expresión de la ADN polimerasa His-Taq. Además, el protocolo44 establecido anteriormente requería pasos de precipitación de polietilemina (PEI) que consumían mucho tiempo, que se pueden omitir con la construcción utilizada aquí, ya que la pureza del producto final no se vio afectada y fue comparable a la polimerasa Taq disponible comercialmente (Figura 2B). La polimerasa Taq purificada migró más lentamente que la comercial debido a la presencia de péptidos enlazadores entre la enzima y la etiqueta histidina en el extremo N-terminal. La ADN polimerasa Taq se produjo con éxito con 0,98 mg/L de cultivo de E. coli de proteína pura.

Expresión y purificación de la transcriptasa inversa doble de MMLV marcada con His y estreptococos
El sistema de expresión de baculovirus se utilizó para expresar MMLV-RT con un doble His C-terminal y Strep-tag en células de insectos (Sf9) como se describe en la Figura 2A. Un estudio previo mostró que el MMLV-RT marcado con C-terminal demuestra una mayor actividad cuando tanto la proteína marcada con N-terminal como la proteína marcada con C-terminal se sintetizaron en gusanos de seda utilizando el sistema de vectores de expresión de gusanos de seda-baculovirus (BEVS de gusano de seda)41. Para producir una proteína MMLV-RT homogénea, se utilizaron las mismas estrategias y protocolos presentados en el estudio mencionado. Como resultado, se logró una mayor expresión y más del 95% de proteína pura con un rendimiento de 7,5 mg/L de cultivo de células de insectos, como se muestra en el resultado del gel SDS-PAGE (Figura 2C).

Optimización y estandarización de la qRT-PCR multiplexada
Se montó y produjo con éxito una prueba de RT-qPCR multiplexada optimizada y desarrollada internamente después de rondas de optimización de la mezcla de tampones y cebadores para detectar simultáneamente tres virus respiratorios comunes diferentes (Figura 3)37. El primer kit fue diseñado para atacar el gen N del SARS-CoV-2, los genes de la influenza A H1N1 y H3N2 y el gen de la influenza B; y el segundo kit es para el gen N del SARS-CoV-2, el MERS ORF1a y los genes upE. Por lo tanto, ambos kits pueden detectar con éxito y simultáneamente los tres objetivos como el flujo de trabajo presentado aquí (Figura 3). Se amplificaron muestras de ARN sintético de cada uno de los virus utilizados en este protocolo, lo que indica la posibilidad de utilizarlo como un kit multiplexado para la detección de virus respiratorios comunes. La sensibilidad de esta prueba diagnóstica es similar a los resultados informados previamente en muestras de pacientes. En los casos en los que los pacientes muestran síntomas similares a los de la gripe, el uso de una RT-qPCR multiplexada en tiempo real ha mostrado resultados comparables con el ensayo multiplexado del SARS-CoV-2, la gripe A y la gripe B45.

Sensibilidad y límite de detección del kit de RT-qPCR multiplexado interno frente a virus respiratorios comunes
La eficacia del kit multiplexado interno se evaluó utilizando dos conjuntos de mezcla de cebadores y el ARN sintético correspondiente para cada kit, como se ilustra en el flujo de trabajo de RT-qPCR multiplexado (Figura 3). Utilizando cada mezcla de cebadores con una dilución en serie de 10 veces de cada mezcla de ARN sintético que oscila entre 10 y 105 copias/μL como plantilla, la sensibilidad, la especificidad y el límite de detección de ambas RT-qPCR multiplexadas desarrolladas pueden determinarse mediante el análisis de curvas estándar. Esto se hace en tres réplicas independientes de cada prueba, para confirmar la eficacia y consistencia del kit de RT-qPCR multiplexado. Como resultado, los dos kits desarrollados aquí pueden amplificar con éxito los tres genes diana simultáneamente con tan solo 10 copias de ARN/reacción, como se ve en la curva de amplificación y el límite de detección (LoD) (Figura 4 y Figura 5). La pendiente y los valores de R2 de cada curva se utilizaron para evaluar la eficiencia de los ensayos individuales (Figura 4 y Figura 5). Los valores de R2 proporcionaron una estimación de la bondad del ajuste lineal a los puntos de datos. En un ensayo de qPCR eficiente, R2 debe estar muy cerca o más de 0,90. Las eficiencias de amplificación de las titulaciones de la influenza A, la influenza B y el SARS-CoV-2 o el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 fueron superiores al 99 % para todos los conjuntos de cebadores (Figura 4 y Figura 5). Además, las pequeñas barras de error demuestran la reproducibilidad de cada kit de RT-qPCR multiplexado. Es importante tener en cuenta que ambos kits multiplexados no mostraron ninguna formación de dímero de cebador, ya que no hay amplificación con el control negativo (datos no mostrados). Por lo tanto, el diseño de ambos kits amplificó todos los genes diana con éxito con fiabilidad, especificidad y sensibilidad.

Figure 1
Figura 1: Resumen esquemático del conjunto del kit de RT-qPCR multiplexado en un solo paso. El montaje del kit comienza con la expresión y purificación de las enzimas necesarias, la ADN polimerasa Taq y la transcriptasa inversa MMLV. Ambas enzimas necesitaban pasar a través de dos columnas, como se ilustra. En segundo lugar, después de la purificación se realizó la optimización de las condiciones de reacción y el programa de ciclos térmicos, lo que dio como resultado condiciones óptimas para el kit de prueba multiplexado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las construcciones de plásmidos y los resultados de purificación de His-Taq Pol y C-His/Strep MMLV-RT. (A) Representación esquemática de los plásmidos de expresión recombinantes His-Taq Pol y C-His/Strep MMLV-RT. Abreviaturas: promotor CSPA - promotor de la proteína A de choque frío; RBS - sitio de unión al ribosoma; 6x His - His-tag con seis histidinas; TEE - elemento de mejora de la traducción; Taq ORF - Marco de lectura abierto Taq Pol; Polh - promotor de poliedrín; MMLV-RT ORF - Marco de lectura abierto MMLV-RT; TEV - sitio objetivo de la proteasa del virus de grabado; 8x His - His-tag con ocho histidinas; Estreptococo - Etiqueta de estreptococo; polyA - Señal de poliadenilación tardía SV40. (B) Análisis SDS-PAGE de His-Taq Pol expresado en células BL21(DE3) de E. coli y Taq polimerasa. (C) Análisis SDS-PAGE de C-His/Estreptococo MMLV-RT purificado expresado en las células Sf9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama esquemático de los dos kits de RT-qPCR de un solo paso optimizados, estandarizados y desarrollados junto con los componentes de la reacción. Cada reacción multiplexada se compone de dNTP, mezcla tampón, mezcla de enzimas, mezcla de cebadores multiplexados y la plantilla de ARN sintético que se va a probar. (A) Influenza A/B, KIT SARS-CoV-2 y (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Las curvas de amplificación y el límite de detección para el kit de RT-qPCR múltiple de un solo paso para la influenza A/B y el SARS-CoV2. Las curvas de amplificación de la RT-qPCR multiplexada se realizaron utilizando una mezcla de ARN sintético con diluciones seriadas de 10 veces (10 a 105 copias/μL) con todas las dianas (A) Influenza A, (C) Influenza B y (E) SARS-CoV-2. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado, mostrando una réplica como ejemplo. El límite de detección para (B) influenza A, (D) influenza B y (F) SARS-CoV-2 se determinó trazando la media de tres valores de Ct replicados contra el número de copias logarítmicas. Se calculó el coeficiente de determinación (R2) y la ecuación de la curva de regresión lineal y se mostraron en cada panel. Las barras de error representan la desviación estándar entre tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Las curvas de amplificación y el límite de detección para el kit de RT-qPCR multiplexado de un solo paso de MERS ORF1a/upE y SARS-CoV2. Las curvas de amplificación de la RT-qPCR multiplexada se realizaron utilizando una mezcla de ARN sintético con diluciones seriadas de 10 veces (10 a 105 copias/μL) con todas las dianas (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE y (E) SARS-Cov-2. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado, mostrando una réplica como ejemplo. El límite de detección para (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE y (F) SARS-CoV-2 se determinó representando gráficamente la media de tres valores de Ct replicados con respecto al número de copias logarítmicas. Se calculó el coeficiente de determinación (R2) y la ecuación de la curva de regresión lineal y se mostraron en cada panel. Las barras de error representan la desviación estándar entre tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: La lista de los componentes del tampón de lisis de la polimerasa Taq. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Tampones de purificación de la polimerasa Taq. La lista de los componentes tampón necesarios para la purificación en dos columnas de la ADN polimerasa Taq. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Tampón de almacenamiento de la polimerasa Taq. La lista de los componentes tampón necesarios para dializar la ADN polimerasa Taq después de la purificación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: La lista de los componentes para el tampón de lisis MMLV-RT. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Tampones de purificación MMLV-RT. La lista de los componentes del tampón necesarios para la purificación de dos columnas de MMLV-RT. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Búfer de almacenamiento MMLV-RT. La lista de los componentes del tampón necesarios para dializar MMLV-RT después de la purificación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Información de cebadores y sondas. La información de secuencia de los cebadores y sondas necesarios para cada mezcla de cebadores multiplexados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Existe una pesada carga económica para el sistema de salud en todo el mundo como resultado de las altas tasas de infección y mortalidad debido a la propagación de virus respiratorios comunes como el SARS-CoV-2, la influenza A/B y las variantes del MERS-CoV 12,19,20. Motivados por el sentido de responsabilidad para aliviar esta carga, nos dimos cuenta de la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, preciso y accesible, como la RT-qPCR, para distinguir entre estos virus comunes en una sola prueba. En virtud de la naturaleza multiplexada de la qRT-PCR, es factible diagnosticar y distinguir el SARS-CoV-2 de otros virus respiratorios, como los virus de la gripe A/B y el MERS-CoV. Con el tiempo, se puede lograr un tratamiento mejor y más preciso de los pacientes utilizando el presente ensayo multiplexado46. Para recapitular, este estudio describe la realización de una prueba interna de RT-qPCR multiplex de un solo paso que puede dirigirse a dos combinaciones diferentes. Cada combinación está compuesta por tres virus respiratorios diferentes para limitar la propagación de estos virus infecciosos y reducir la carga económica del sistema sanitario.

El presente kit de RT-qPCR multiplexado puede dirigirse a dos combinaciones de virus respiratorios comunes (SARS-CoV-2, Influenza A/B) y (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a). El protocolo descrito es fácil, sencillo de seguir y mucho más barato que los kits de RT-qPCR de un solo paso disponibles en el mercado. Otra ventaja fueron las propiedades multiplexadas del kit que puede dirigirse a múltiples objetivos genéticos virales mediante la utilización de diferentes combinaciones de sondas y cebadores. Por lo tanto, la versatilidad y simplicidad del kit permiten una implementación sencilla en entornos con recursos limitados. Además, el kit es adecuado para pruebas exhaustivas que dan como resultado un diagnóstico exacto y preciso que puede ayudar a limitar la propagación y la coinfección de múltiples virus respiratorios.

Se realizaron ensayos preliminares para garantizar que todas las dianas se amplificaran con éxito y con alta fidelidad para limitar la formación de productos no específicos. En primer lugar, pasamos por varias rondas de optimización de los componentes de la mezcla tampón y sus respectivas concentraciones en la mezcla tampón. En segundo lugar, optimizamos los cebadores y sus correspondientes concentraciones tanto en la mezcla de cebadores como en la reacción de PCR. En tercer lugar, optimizamos la composición de la mezcla enzimática para maximizar su actividad y minimizar el efecto inhibidor de MMLV-RT sobre la actividad de la polimerasaTaq 47. En cuarto lugar, optimizamos las condiciones del ciclo térmico teniendo en cuenta las limitaciones para la estabilidad térmica de ambas enzimas. Incorporando las mejoras antes mencionadas, la versión optimizada de nuestro kit de RT-qPCR multiplexado presentado aquí fue capaz de detectar hasta 10 copias/reacciones de ARN con alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad.

Se deben tener en cuenta algunas precauciones para garantizar la alta eficiencia y la implementación exitosa del ensayo RT-qPCR multiplex, para prevenir inhibidores y evitar errores de pipeteo. Dado que cada instalación es única en su configuración e instrumentación, aquí hay algunos pasos que pueden ayudar al construir un kit de este tipo: primero, se deben usar guantes en todo momento para evitar la presencia de contaminación e inhibidor de PCR. En segundo lugar, asegúrese de utilizar puntas de filtro resistentes a los aerosoles y utilizar una pipeta calibrada. Además, asegúrese de utilizar agua de grado PCR. El uso de un control sin plantilla ayudará a verificar la presencia de cualquier contaminación. Es importante tener en cuenta que la mezcla maestra debe estar preparada para todas las réplicas para evitar posibles contaminaciones y variaciones en el pipeteo. Se deben tener en cuenta otros consejos de solución de problemas para mantener la calidad de la sonda, como aliquotar el stock y evitar el uso de agua para diluirlo. Es importante seguir las recomendaciones del fabricante sobre el almacenamiento y la dilución de la imprimación y la sonda utilizadas. Por lo tanto, estos sencillos consejos ayudarán a mantener el éxito del ensayo RT-qPCR multiplex y garantizarán su alta eficiencia.

Aunque los ensayos de RT-qPCR multiplexados desarrollados en esta investigación han mostrado buenos resultados cuando se prueban con los ARN virales sintéticos, su eficacia en un entorno clínico real aún debe evaluarse y validarse. Desafortunadamente, la escasez de muestras clínicas dificulta la determinación de las especificidades y la sensibilidad del ensayo para los virus incluidos en esta investigación. Sin embargo, cabe mencionar que el LOD (límite de detección), que indica el número mínimo de copias que se pueden detectar en el 100% de las muestras, se estableció a través de una regresión lineal estadísticamente probada. Esto proporciona potencial para el diagnóstico clínico y es un hallazgo importante de la investigación.

En este estudio se desarrolló y validó con éxito un ensayo interno de RT-qPCR multiplex de un solo paso basado en sondas con alta eficacia. El SARS-CoV-2 puede detectarse y distinguirse fácilmente de otros virus respiratorios comunes, como se ha explicado anteriormente, con alta eficiencia y fiabilidad en un solo tubo de ensayo. Por lo tanto, la dependencia de esta función multiplexada ayudará a aumentar el rendimiento del diagnóstico y ahorrará tiempo, costo y muestra en comparación con otros enfoques de prueba y PCR singleplex. Con todo, la posibilidad de que los virus respiratorios circulen juntos es alta y esta RT-qPCR múltiple de un solo paso será muy ventajosa.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a través de fondos básicos y el National Term Grand Challenge (NTGC) a S.M.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

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