細胞外小胞組織因子活性アッセイ
Summary
ここでは、社内の細胞外小胞組織因子活性アッセイについて説明します。活性ベースのアッセイおよび抗原ベースのアッセイは、ヒト血漿サンプルからの細胞外小胞中の組織因子を測定するために使用されています。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも高い感度と特異性を持っています。
Abstract
組織因子(TF)は、第VII因子およびFVIIaの膜貫通型受容体です。TF/FVIIa複合体は、FIXとFXの両方を活性化することにより、凝固カスケードを開始します。TFは細胞外小胞(EV)の形で細胞から循環中に放出されます。TF陽性(+)EVのレベルは、がん、細菌およびウイルス感染、肝硬変などのさまざまな疾患で増加し、血栓症、播種性血管内凝固、疾患の重症度、および死亡率に関連しています。血漿中のTF+ EVを測定するには、抗原アッセイと活性ベースアッセイの2つの方法があります。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも感度と特異性が高いことがデータで示されています。本稿では、2段階のFXa生成アッセイに基づく当社独自のEVTF活性アッセイについて述べる。TF+ EV含有サンプルにFVIIa、FX、およびカルシウムを添加して、抗TF抗体の存在下および非存在下でFXaを生成し、TF依存性FXa生成とTF非依存性FXa生成を区別します。FXaで切断された発色基質を使用してFXaレベルを決定し、再置換組換えTFで生成された標準曲線を使用してTF濃度を決定します。この社内EVTF活性アッセイは、市販のTF活性アッセイよりも高い感度と特異性を備えています。
Introduction
血液凝固は、第VII/VIIa因子(F)が組織因子(TF)1に結合することで開始されます。TF/FVIIa複合体は、FIXとFXの両方を活性化し、血液凝固を活性化します1。完全長の膜結合型TFには、暗号化とアクティブの2つの形式があります。さらに、選択的スプライス形式のTF(asTF)があります。細胞膜の外側のリーフレットにあるスフィンゴミエリンとホスファチジルコリンは、TFを暗号化された状態に維持します2,3,4。細胞が活性化または損傷されると、リン脂質スクランブラーゼはホスファチジルセリンおよび他の負に帯電したリン脂質を外尖1に転移させる。細胞の活性化はまた、酸性スフィンゴミエリナーゼの外側のリーフレットへの転座をもたらし、そこでスフィンゴミエリンをセラミド5に分解します。これら 2 つのメカニズムは、暗号化された TF をアクティブな形式に変換します。また、プロテインジスルフィドイソメラーゼは、暗号化されたTF中のCys186とCys209の間のジスルフィド結合形成を媒介し、TF 6,7,8の解読をもたらすことも提案されています。asTFも循環中に存在しますが、膜貫通ドメインを欠いているため、可溶性です9,10。重要なことに、asTFは、全長の活性TF10,11と比較して、非常に低いレベルの凝固促進活性を有する。
細胞外小胞(EV)は、休止中、活性化中、および死にかけている宿主細胞、および癌細胞から放出されます12。EVは親細胞からタンパク質を発現する12.活性TF担持EVは、活性化された単球、内皮細胞、および腫瘍細胞から循環中に放出される13,14,15。血漿中のTFレベルは、活性および抗原ベースのアッセイによって測定できます。抗原ベースのアッセイには、ELISAとフローサイトメトリーが含まれます16。活性ベースのアッセイには、1段階と2段階のTF活性アッセイの2種類があります。1段階アッセイは、血漿ベースの凝固アッセイに基づいています。TF含有サンプルを血漿に添加し、再石灰化後に血栓を形成する時間を測定します。2段階アッセイは、FVIIまたはFVIIa、FX、およびカルシウムを添加することにより、サンプルのFXa生成を測定します。FXaレベルは、FXaによって切断された基質を使用して決定されます。
1段階および2段階のTF活性アッセイでは、組換えTFで生成された検量線を使用してTF濃度が決定されます。2段階アッセイは、1段階アッセイよりも感度と特異性が高くなります。多くの研究により、活性ベースのアッセイは抗原ベースのアッセイよりも高い感度と特異性があることが確認されています17、18、19、20、21。さらに、当社の社内活性アッセイは、商業活性アッセイよりも高い感度と特異性を持っています22。健康な人は、血漿中のEVTF活性のレベルが非常に低いか、検出できません。対照的に、癌、肝硬変、敗血症、ウイルス感染などの病理学的状態の個人は、検出可能なレベルのEVTF活性を持ち、これは血栓症、播種性血管内凝固、疾患の重症度、および死亡率に関連しています23,24,25,26,27,28。ここでは、この社内の2段階のEVTF活性アッセイについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、当社社内EVTF活性アッセイのプロトコルを示します。このプロトコルには3つの重要なステップがあります。EVペレットを再構成する場合、EVペレットが見えない場合でも、EVペレットの位置でピペットを上下に動かすことが重要です。EVペレットの再構成が不完全な場合、サンプルのEVTF活性値の偽陰性または過小評価が発生します。第二に、カルシウムなしではFXa生成を生成できな?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH NHLBI R35HL155657(N.M.)とJohn C. Parker教授(N.M.)の支援を受けました。Sierra J. Archibald氏の有益なコメントに感謝します
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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