Hücre Dışı Vezikül Doku Faktörü Aktivite Testi
Summary
Burada kurum içi hücre dışı vezikül dokusu faktör aktivite testini açıklıyoruz. İnsan plazma örneklerinden hücre dışı veziküllerdeki doku faktörünü ölçmek için aktiviteye dayalı testler ve antijen bazlı testler kullanılmıştır. Aktiviteye dayalı tahliller, antijen bazlı tahlillere göre daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir.
Abstract
Doku faktörü (TF), faktör (F) VII ve FVIIa için bir transmembran reseptörüdür. TF/FVIIa kompleksi, hem FIX hem de FX’i etkinleştirerek pıhtılaşma kademesini başlatır. TF, hücrelerden hücre dışı veziküller (EV’ler) şeklinde dolaşıma salınır. Kanser, bakteriyel ve viral enfeksiyonlar ve siroz dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda TF pozitif (+) EV’lerin seviyesi artar ve tromboz, yaygın damar içi pıhtılaşma, hastalık şiddeti ve mortalite ile ilişkilidir. Plazmada TF+ EV’leri ölçmenin iki yolu vardır: antijen ve aktivite bazlı tahliller. Veriler, aktivite bazlı testlerin antijen bazlı testlerden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğunu göstermektedir. Bu makale, iki aşamalı bir FXa üretim testine dayanan kurum içi EVTF aktivite testimizi açıklamaktadır. TF’ye bağımlı FXa neslini TF’den bağımsız FXa neslinden ayırt etmek için anti-TF antikorunun varlığında ve yokluğunda FXa oluşturmak için TF+ EV içeren numunelere FVIIa, FX ve kalsiyum eklenir. FXa seviyesini belirlemek için FXa tarafından parçalanmış bir kromojenik substrat kullanılırken, TF konsantrasyonunun belirlenmesi için relipidlenmiş bir rekombinant TF ile oluşturulan standart bir eğri kullanılır. Bu kurum içi EVTF aktivite testi, ticari bir TF aktivite testinden daha yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir.
Introduction
Faktör (F) VII/VIIa’nın doku faktörüne (TF)1 bağlanması ile kan pıhtılaşması başlatılır. TF / FVIIa kompleksi, kan pıhtılaşmasını etkinleştirmek için hem FIX hem de FX’i aktive eder1. Tam uzunlukta, membrana bağlı TF’nin iki biçimi vardır: şifreli ve aktif. Ek olarak, alternatif olarak eklenmiş bir TF formu (asTF) vardır. Hücre zarının dış broşüründeki sfingomyelin ve fosfatidilkolin, TF’yi şifreli bir durumdatutar 2,3,4. Hücreler aktive edildiğinde veya hasar gördüğünde, fosfolipid scramblase, fosfatidilserin ve diğer negatif yüklü fosfolipidleri dış broşüre1 aktarır. Hücrelerin aktivasyonu ayrıca asit sfingomiyelinazın dış broşüre translokasyonu ile sonuçlanır ve burada sfingomyelini seramid5’e indirger. Bu iki mekanizma şifreli TF’yi aktif forma dönüştürür. Ayrıca, protein disülfid izomerazın, şifreli TF’de Cys186 ve Cys209 arasında disülfid bağı oluşumuna aracılık ettiği ve bunun da TF 6,7,8’in şifresinin çözülmesine neden olduğu öne sürülmektedir. asTF de dolaşımda bulunur ancak transmembran alanından yoksundur ve bu nedenle çözünür 9,10. Daha da önemlisi, asTF, tam uzunlukta aktif TF10,11’e kıyasla çok düşük prokoagülan aktivite seviyelerine sahiptir.
Hücre dışı veziküller (EV’ler) dinlenen, aktive olan ve ölmekte olan konakçı hücrelerin yanı sıra kanser hücrelerindensalınır 12. EV’ler proteinleri ebeveyn hücrelerinden eksprese eder12. Aktif TF taşıyan EV’ler, aktive edilmiş monositlerden, endotel hücrelerinden ve tümör hücrelerinden dolaşımasalınır 13,14,15. Plazmadaki TF seviyeleri, aktivite ve antijen bazlı tahlillerle ölçülebilir. Antijen bazlı testler arasında ELISA ve akış sitometrisi16 bulunur. İki farklı aktivite tabanlı tahlil vardır: bir ve iki aşamalı TF aktivite tahlilleri. Tek aşamalı tahlil, plazma bazlı bir pıhtılaşma tahliline dayanır. TF içeren numune plazmaya eklenir ve yeniden kalsifikasyondan sonra pıhtı oluşturma süresi ölçülür. İki aşamalı tahlil, FVII veya FVIIa, FX ve kalsiyum ekleyerek FXa numune neslini ölçer. FXa seviyeleri, FXa tarafından parçalanmış bir substrat kullanılarak belirlenir.
Hem bir hem de iki aşamalı TF aktivite testlerinde, TF konsantrasyonu, rekombinant TF ile oluşturulan standart bir eğri kullanılarak belirlenir. İki aşamalı tahliller, tek aşamalı tahlilden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. Birçok çalışma, aktiviteye dayalı testlerin antijen bazlı testlerden daha yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olduğunu doğrulamıştır 17,18,19,20,21. Ek olarak, kurum içi faaliyet tahlili, ticari faaliyet tahlilinden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir22. Sağlıklı bireyler, plazmada çok düşük veya tespit edilemeyen EVTF aktivitesine sahiptir. Buna karşılık, kanser, siroz, sepsis ve viral enfeksiyon gibi patolojik rahatsızlıkları olan bireyler, saptanabilir düzeyde EVTF aktivitesine sahiptir ve bu, tromboz, yaygın damar içi pıhtılaşma, hastalık şiddeti ve mortalite ile ilişkilidir 23,24,25,26,27,28. Burada, bu kurum içi iki aşamalı EVTF aktivite tahlilini açıklayacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, kurum içi EVTF aktivite testimizin protokolü sunulmaktadır. Protokolde üç kritik adım vardır. EV peletini sulandırırken, görünür olmasa bile EV peletinin bulunduğu yerde yukarı ve aşağı pipetlemek önemlidir. EV peletinin eksik sulandırılması, numunelerin EVTF aktivite değerlerinin yanlış negatif veya eksik tahmin edilmesine neden olacaktır. İkinci olarak, HBSA-Ca(+) kullanmak protokol adımı 6.5’te kritik öneme sahiptir, çünkü FXa üretimi kalsiyum olmadan oluşturulamaz. Üçüncü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) ve John C. Parker profesörlüğü (N.M.) tarafından desteklenmiştir. Yararlı yorumları için Bayan Sierra J. Archibald’a teşekkür ederiz
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor – one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
