Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio
Summary
Qui, presentiamo una batteria di test comportamentali completa, tra cui il nuovo serbatoio, Shoaling e i test di preferenza sociale, per determinare efficacemente i potenziali effetti neurotossici delle sostanze chimiche (ad esempio, metanfetamina e glifosato) sul pesce zebra adulto utilizzando un singolo acquario. Questo metodo è rilevante per la neurotossicità e la ricerca ambientale.
Abstract
La presenza di effetti neuropatologici si è rivelata, per molti anni, il principale endpoint per valutare la neurotossicità di una sostanza chimica. Tuttavia, negli ultimi 50 anni, gli effetti delle sostanze chimiche sul comportamento delle specie modello sono stati attivamente studiati. Progressivamente, gli endpoint comportamentali sono stati incorporati nei protocolli di screening neurotossicologico e questi risultati funzionali sono ora utilizzati di routine per identificare e determinare la potenziale neurotossicità delle sostanze chimiche. I saggi comportamentali nel pesce zebra adulto forniscono un mezzo standardizzato e affidabile per studiare un’ampia gamma di comportamenti, tra cui ansia, interazione sociale, apprendimento, memoria e dipendenza. I saggi comportamentali nel pesce zebra adulto in genere comportano il posizionamento del pesce in un’arena sperimentale e la registrazione e l’analisi del loro comportamento utilizzando un software di tracciamento video. I pesci possono essere esposti a vari stimoli e il loro comportamento può essere quantificato utilizzando una varietà di metriche. Il nuovo test della vasca è uno dei test più accettati e ampiamente utilizzati per studiare il comportamento ansioso nei pesci. I test di shoaling e di preferenza sociale sono utili per studiare il comportamento sociale del pesce zebra. Questo saggio è particolarmente interessante in quanto viene studiato il comportamento dell’intera secca. Questi saggi hanno dimostrato di essere altamente riproducibili e sensibili alle manipolazioni farmacologiche e genetiche, rendendoli strumenti preziosi per lo studio dei circuiti neurali e dei meccanismi molecolari alla base del comportamento. Inoltre, questi saggi possono essere utilizzati nello screening farmacologico per identificare composti che possono essere potenziali modulatori del comportamento.
In questo lavoro mostreremo come applicare gli strumenti comportamentali nella neurotossicologia dei pesci, analizzando l’effetto della metanfetamina, una droga ricreativa, e del glifosato, un inquinante ambientale. I risultati dimostrano il contributo significativo dei saggi comportamentali nel pesce zebra adulto alla comprensione degli effetti neurotossicologici degli inquinanti ambientali e dei farmaci, oltre a fornire informazioni sui meccanismi molecolari che possono alterare la funzione neuronale.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è una specie di vertebrato modello popolare per l’ecotossicologia, la scoperta di farmaci e gli studi di farmacologia di sicurezza. Il suo basso costo, gli strumenti genetici molecolari ben consolidati e la conservazione dei processi fisiologici chiave coinvolti nella morfogenesi e nel mantenimento del sistema nervoso rendono il pesce zebra un modello animale ideale per la ricerca neuroscientifica, inclusa la tossicologia neurocomportamentale 1,2. L’endpoint principale per valutare la neurotossicità di una sostanza chimica era, fino a poco tempo fa, la presenza di effetti neuropatologici. Ultimamente, tuttavia, gli endpoint comportamentali sono stati incorporati nei protocolli di screening neurotossicologico e questi risultati funzionali sono ora comunemente utilizzati per identificare e determinare la potenziale neurotossicità delle sostanze chimiche 3,4. Inoltre, gli endpoint comportamentali sono molto rilevanti da un punto di vista ecologico, in quanto anche un cambiamento comportamentale molto lieve nei pesci potrebbe mettere in pericolo la sopravvivenza dell’animale in condizioni naturali5.
Uno dei saggi comportamentali più utilizzati nella ricerca sul pesce zebra adulto è il nuovo tank test (NTT), che misura il comportamento ansioso 6,7. In questo saggio, i pesci sono esposti a novità (i pesci sono posti in una vasca sconosciuta), a un lieve stimolo avversivo e si osservano le loro risposte comportamentali. L’NTT viene utilizzato principalmente per valutare l’attività locomotoria basale, la geotassia, il congelamento e i movimenti irregolari dei pesci. Erratic8 è caratterizzato da bruschi cambi di direzione (zigzaging) e ripetuti episodi di accelerazioni (darting). È una reazione di allarme e di solito si osserva prima o dopo episodi di congelamento. Il comportamento di congelamento corrisponde a una completa cessazione dei movimenti del pesce (ad eccezione dei movimenti opercolari e oculari) sul fondo della vasca, distinto dall’immobilità causata dalla sedazione, che provoca ipolocomozione, acinesia e affondamento8. Il congelamento è solitamente correlato a un elevato stato di stress e ansia e fa anche parte del comportamento sottomesso. I comportamenti complessi sono ottimi indicatori dello stato d’ansia degli animali. È stato dimostrato che la NTT è sensibile alla manipolazione farmacologica e genetica9, il che la rende uno strumento prezioso per studiare le basi neurali dell’ansia e dei disturbi correlati.
Il pesce zebra è una specie altamente sociale, quindi possiamo misurare una vasta gamma di comportamenti sociali. Il test di shoaling (ST) e il test di preferenza sociale (SPT) sono i test più utilizzati per valutare il comportamento sociale10. L’ST misura la tendenza dei pesci a raggrupparsi11 quantificando il loro comportamento spaziale e i loro schemi di movimento. ST è utile per studiare le dinamiche di gruppo, la leadership, l’apprendimento sociale e la comprensione del comportamento sociale di molte specie ittiche12. L’SPT nel pesce zebra adulto è stato adattato dalla preferenza di Crawley per il test di novità sociale per i topi13 ed è diventato rapidamente un test comportamentale popolare per lo studio dell’interazione sociale in questa specie modello14. Questi due test sono stati anche adattati per l’uso in saggi di screening farmacologico e si sono dimostrati promettenti per l’identificazione di nuovi composti che modulano il comportamento sociale15,16.
In generale, i saggi comportamentali nel pesce zebra adulto sono strumenti potenti che possono fornire preziose informazioni sui meccanismi comportamentali o sui neurofenotipi dei composti attivi e delle droghe abusate17. Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare questi strumenti comportamentali7 con risorse materiali di base e come applicarli nei saggi di tossicità per caratterizzare gli effetti di un’ampia gamma di composti neuroattivi. Inoltre, vedremo che gli stessi test possono essere applicati per valutare gli effetti neurocomportamentali dell’esposizione acuta a un composto neuroattivo (metanfetamina) ma anche per caratterizzare questi effetti dopo l’esposizione cronica a concentrazioni ambientali di un pesticida (glifosato).
Protocol
Representative Results
Discussion
I comportamenti ansiosi caratteristici osservati nella NTT sono stati correlati positivamente con i livelli di serotonina analizzati nel cervello21. Ad esempio, dopo l’esposizione alla para-clorofenilalalanina (PCPA), un inibitore della biosintesi della 5-HT, i pesci hanno mostrato geotassi positiva e livelli cerebrali di 5-HTdiminuiti 22, risultati molto simili a quelli ottenuti con la metanfetania. Pertanto, la diminuzione dei livelli di serotonina cerebrale e la visualiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da “Agencia Estatal de Investigación” del Ministero spagnolo della Scienza e dell’Innovazione (progetto PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centro di eccellenza Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz è stata sostenuta da una borsa di dottorato (PRE2018-083513) cofinanziata dal governo spagnolo e dal Fondo sociale europeo (FSE).
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- . Social behavior in Zebrafish Available from: https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012)
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, (2005).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., Kalueff, A., Cachat, J., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. 51, (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
