Summary

Evaluación de la Neurotoxicidad en Danio rerio Adulto mediante una Batería de Pruebas de Comportamiento en un Tanque Único

Published: November 03, 2023
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Summary

Aquí, presentamos una batería integral de pruebas de comportamiento, que incluye el nuevo tanque, Shoaling y pruebas de preferencia social, para determinar de manera efectiva los posibles efectos neurotóxicos de los productos químicos (por ejemplo, metanfetamina y glifosato) en el pez cebra adulto utilizando un solo tanque. Este método es relevante para la neurotoxicidad y la investigación ambiental.

Abstract

La presencia de efectos neuropatológicos resultó ser, durante muchos años, el principal criterio de valoración para evaluar la neurotoxicidad de una sustancia química. Sin embargo, en los últimos 50 años, se han investigado activamente los efectos de los productos químicos en el comportamiento de las especies modelo. Progresivamente, los criterios de valoración conductuales se incorporaron a los protocolos de cribado neurotoxicológico, y estos resultados funcionales se utilizan ahora de forma rutinaria para identificar y determinar la posible neurotoxicidad de las sustancias químicas. Los ensayos conductuales en peces cebra adultos proporcionan un medio estandarizado y confiable para estudiar una amplia gama de comportamientos, incluida la ansiedad, la interacción social, el aprendizaje, la memoria y la adicción. Los ensayos de comportamiento en el pez cebra adulto suelen consistir en colocar a los peces en un campo experimental y registrar y analizar su comportamiento mediante un software de seguimiento de vídeo. Los peces pueden estar expuestos a diversos estímulos y su comportamiento se puede cuantificar utilizando una variedad de métricas. La nueva prueba de tanque es una de las pruebas más aceptadas y ampliamente utilizadas para estudiar el comportamiento similar a la ansiedad en los peces. Las pruebas de cardúmenes y preferencias sociales son útiles para estudiar el comportamiento social del pez cebra. Este ensayo es particularmente interesante ya que se estudia el comportamiento de todo el cardúmen. Estos ensayos han demostrado ser altamente reproducibles y sensibles a las manipulaciones farmacológicas y genéticas, lo que los convierte en herramientas valiosas para estudiar los circuitos neuronales y los mecanismos moleculares que subyacen al comportamiento. Además, estos ensayos se pueden utilizar en el cribado de fármacos para identificar compuestos que pueden ser posibles moduladores del comportamiento.

En este trabajo mostraremos cómo aplicar herramientas conductuales en neurotoxicología de peces, analizando el efecto de la metanfetamina, una droga recreativa, y el glifosato, un contaminante ambiental. Los resultados demuestran la contribución significativa de los ensayos conductuales en pez cebra adulto a la comprensión de los efectos neurotoxicológicos de los contaminantes ambientales y los fármacos, además de proporcionar información sobre los mecanismos moleculares que pueden alterar la función neuronal.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) es una especie de vertebrado modelo popular para estudios de ecotoxicología, descubrimiento de fármacos y farmacología de seguridad. Su bajo costo, sus herramientas genéticas moleculares bien establecidas y la conservación de los procesos fisiológicos clave involucrados en la morfogénesis y el mantenimiento del sistema nervioso hacen del pez cebra un modelo animal ideal para la investigación en neurociencia, incluida la toxicología neuroconductual 1,2. El principal criterio de valoración para evaluar la neurotoxicidad de una sustancia química era, hasta hace poco, la presencia de efectos neuropatológicos. Últimamente, sin embargo, los criterios de valoración conductuales se han incorporado a los protocolos de cribado neurotoxicológico, y estos resultados funcionales se utilizan ahora comúnmente para identificar y determinar la neurotoxicidad potencial de las sustancias químicas 3,4. Además, los criterios de valoración conductuales son muy relevantes desde el punto de vista ecológico, ya que incluso un cambio de comportamiento muy leve en los peces podría poner en peligro la supervivencia del animal en condiciones naturales5.

Uno de los ensayos conductuales más utilizados en la investigación del pez cebra adulto es la nueva prueba de tanque (NTT), que mide el comportamiento similar a la ansiedad 6,7. En este ensayo, los peces se exponen a la novedad (los peces se colocan en un tanque desconocido), a un estímulo aversivo leve y se observan sus respuestas conductuales. La NTT se utiliza para evaluar la actividad locomotora basal, la geotaxis, la congelación y los movimientos erráticos de los peces, principalmente. El 8 erráticose caracteriza por cambios bruscos de dirección (zigzagueo) y episodios repetidos de aceleraciones (dardos). Es una reacción de alarma y suele observarse antes o después de los episodios de congelación. El comportamiento de congelación corresponde a un cese completo de los movimientos del pez (excepto los movimientos operculares y oculares) mientras se encuentra en el fondo del tanque, a diferencia de la inmovilidad causada por la sedación, que causa hipolocomoción, acinesia y hundimiento8. La congelación suele estar relacionada con un alto estado de estrés y ansiedad y también forma parte de la conducta sumisa. Los comportamientos complejos son excelentes indicadores del estado de ansiedad de los animales. Se ha demostrado que la NTT es sensible a la manipulación farmacológica y genética9, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudiar las bases neurales de la ansiedad y los trastornos relacionados.

El pez cebra es una especie altamente social, por lo que podemos medir una amplia gama de comportamientos sociales. El test de cardúmenes (ST) y el test de preferencia social (SPT) son los ensayos más utilizados para evaluar el comportamiento social10. El ST mide la tendencia de los peces a agruparse11 cuantificando su comportamiento espacial y patrones de movimiento. La TS es útil para estudiar la dinámica de grupo, el liderazgo, el aprendizaje social y la comprensión del comportamiento social de muchas especies de peces12. El SPT en pez cebra adulto se adaptó de la preferencia de Crawley por la prueba de novedad social para ratones13 y rápidamente se convirtió en un ensayo de comportamiento popular para el estudio de la interacción social en esta especie modelo14. Estas dos pruebas también han sido adaptadas para su uso en ensayos de detección de drogas y se han mostrado prometedoras para la identificación de nuevos compuestos que modulan el comportamiento social15,16.

En general, los ensayos conductuales en pez cebra adulto son herramientas poderosas que pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de comportamiento o los neurofenotipos de los compuestos activos y los fármacos de los que se abusa17. Este protocolo detalla cómo implementar estas herramientas conductuales7 con recursos materiales básicos y cómo aplicarlas en ensayos de toxicidad para caracterizar los efectos de una amplia gama de compuestos neuroactivos. Además, veremos que las mismas pruebas se pueden aplicar para evaluar los efectos neuroconductuales de la exposición aguda a un compuesto neuroactivo (metanfetamina) pero también para caracterizar estos efectos después de la exposición crónica a concentraciones ambientales de un plaguicida (glifosato).

Protocol

El estricto cumplimiento de las normas éticas garantiza el bienestar y el trato adecuado del pez cebra utilizado para la experimentación. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo las directrices establecidas por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (CID-CSIC). Los protocolos y resultados que se presentan a continuación se realizaron bajo la licencia otorgada por el gobierno local (acuerdo número 11336). 1. Alojamiento de animales para prueb…

Representative Results

En esta sección, veremos algunas posibles aplicaciones de estas herramientas conductuales en la neurotoxicología de peces. Los siguientes resultados corresponden a la caracterización de los efectos agudos o atracones de la metanfetamina (METH), una droga recreativa, y los efectos subcrónicos del glifosato, uno de los principales herbicidas encontrados en los ecosistemas acuáticos. Caracterización de un modelo de neurotoxicidad por atracón de metanfetamina en pez cebra adulto</st…

Discussion

Las conductas de ansiedad características observadas en la NTT se han correlacionado positivamente con los niveles de serotonina analizados en el cerebro21. Por ejemplo, después de la exposición a la paraclorofenilalanina (PCPA), un inhibidor de la biosíntesis de 5-HT, los peces exhibieron geotaxis positiva, así como una disminución de los niveles cerebrales de 5-HT22, resultados muy similares a los obtenidos con METH. Por lo tanto, la disminución de los niveles de s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo ha contado con el apoyo de la Agencia Estatal de Investigación del Ministerio de Ciencia e Innovación (proyecto PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz ha contado con el apoyo de una beca de doctorado (PRE2018-083513) cofinanciada por el Gobierno de España y el Fondo Social Europeo (FSE).

Materials

Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

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