이 프로토콜은 뇌 혈액 장벽의 신뢰할 수 있고 효율적인 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스 대뇌 혈관 내피 세포 bEnd.3를 사용하고 막관통 전기 저항을 측정합니다.
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이 논문에서
요약
초록
혈액뇌장벽(BBB)은 미세혈관 내피세포, 성상세포, 주위세포로 구성된 역동적인 생리학적 구조입니다. BBB는 유해 물질의 제한된 통과, 영양소 흡수 및 뇌의 대사 산물 제거 사이의 상호 작용을 조정함으로써 중추 신경계 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. BBB의 체외 모델 구축은 신경 장애의 병태생리학을 탐구하고 약리학적 치료법을 만드는 데 유용한 도구입니다. 이 연구는 24웰 플레이트의 상부 챔버에 bEnd.3 세포를 파종하여 시험관 내 단층 BBB 세포 모델을 생성하는 절차를 설명합니다. 세포 장벽 기능의 무결성을 평가하기 위해 기존의 상피 세포 전압계를 사용하여 정상 세포와 CoCl2 유도 저산소 세포의 막횡단 전기 저항을 실시간으로 기록했습니다. 우리는 위의 실험이 BBB의 체외 모델 및 중추 신경계 질환의 장애를 치료하는 약물을 만드는 데 효과적인 아이디어를 제공할 것으로 기대합니다.
서론
BBB는 혈관 내피 세포, 주위 세포, 성상 세포, 뉴런 및 기타 세포 구조로 구성된 혈액 순환과 신경 조직 사이의 독특한 생물학적 인터페이스입니다1. 혈액과 뇌 사이의 이온, 화학 물질 및 세포의 흐름은 이 장벽에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이 항상성은 독소와 병원균으로부터 신경 조직을 보호하는 동시에 뇌 신경의 적절한 작동을 가능하게 합니다 2,3. BBB의 무결성을 유지하면 신경 기능 장애, 부종 및 신경 염증과 같은 중추 신경계에 영향을 미치는 장애의 발생 및 진행을 효과적으로 예방할 수 있습니다4. 그러나 BBB의 독특한 생리학적 특성으로 인해 저분자 약물의 98% 이상과 고분자 약물의 100% 이상이 중추신경계에 들어가는 것을 방지할 수 있다5. 따라서 중추 신경계에 대한 약물 개발 중에 BBB를 통한 약물 침투를 증가시키는 것은 치료 효능을 달성하는 데 필수적입니다 6,7. 기질의 컴퓨터 시뮬레이션 스크리닝으로 인해 약물 후보 물질이 BBB를 통....
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프로토콜
참고: 마우스 뇌 유래 내피 세포.3(bEnd.3)을 24웰 플레이트의 챔버에 접종하여 특정 배지 조건에서 BBB의 간단한 시험관 내 모델을 구성했습니다. 정상 세포와 저산소 세포의 TEER은 TEER 미터로 측정하였다(도 1 및 도 2).
1. 용액 준비
- FBS(10%, v/v), 100U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 세포 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
- 100μL DMSO 용액에 1.30mgCoCl2를 첨가하여 100mMCoCl2 원액을 준비합니다.
참고: 위의 모든 용액을 4°C 조건에서 보관하고, 원액을 원하는 농도에 따라 희석한 후 사용하였다. - 5mL의 이중 증류수에 차아염소산나트륨 용액 2mL를 첨가하여 38% 차아염소산나트륨 용액(v/v)을 준비합니다.
2. 세포 배양 및 세포 생존력
- 1 x 10
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결과
이 프로토콜은 경내피 저항기 측정기에 설정된 매개변수에 따라 세포의 저항 값의 변화를 기록할 수 있었습니다. 다양한 농도의 CoCl2로 처리된 bEnd.3 세포(살아있는 세포의 수)의 생존력은 CCK-8 분석으로 스크리닝되었습니다. CoCl2에 의해 생성된 더 큰 세포 손상은 더 낮은 세포 생존율로 나타났습니다. 300μM의 CoCl2가 시험관 내에서 유의미한 세포독성을 나타낸다는 것을 발견했으며, 이 농도는 다음 실험에 사용되었습니다(그림 3A). bEnd.3의 성장 저항 변화를 모니터링한 결과, 세포 TEER 값이5일째 되는 날에 안정화되기 시작하는 것을 발견했습니다. 6일째 되는 날에 플레이트의 상부챔버에 300μM CoCl2를 추가하여 유도된 저산소성 손상은 12시간 및 24시간 시점 모두에서 대조군에 비해 TEER 값이 크게 감소했습니.......
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토론
가장 발달된 신체 기관 중 하나인 뇌는 기억, 인지, 청각, 후각, 운동 등 다양하고 복잡한 생리적 과정을 관장한다27. 뇌는 인체에서 가장 복잡하고 병든 기관 중 하나이다. 많은 중추신경계 장애의 발생은 대기 오염, 불규칙한 식습관 및 기타 요인을 포함한 요인으로 인해 해마다 증가하는 경향을 보인다 27,28,29. 뇌졸중, 간질, 알츠하이머병(AD)과 같은 일부 중추신경계 질환의 시작과 진행이 BBB30,31,32의 성장과 밀접한 상관관계가 있다는 것은 흥미롭습니다. 뇌 기능 장애를 동반한 대부분의 질환을 치료하기 위한 기본 개념은 BBB 기능적 항상성.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
중국 국립 자연 과학 재단(82274207 및 82104533), 닝샤 중점 연구 개발 프로그램(2023BEG02012) 및 청두 중의학 대학 Xinglin Scholar Research Promotion Project(XKTD2022013)의 재정적 지원에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 트랜스웰 플레이트 | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µ m) | 10522023 | |
| 75% 에탄올 | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2023052901 | |
| 96웰 플레이트 | Guangzhou Jet Bio-filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco의 변형 독수리 배지 (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| 소 태아 혈청 | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | 9.0.0(121) | |
| 마트리겔(콜라겐 IV 포함) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 소프트웨어 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| 페니실린-스트렙토마이신(100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| 차아염소산나트륨 | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2022091501 | |
| 멤브레인 횡단 저항 측정기 | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
참고문헌
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).
- Bagchi, S., et al. I....
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재인쇄 및 허가
