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신경과학

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65938
, , , , , , ,
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy,Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外 モデルを記述する。この方法では、マウスの脳血管内皮細胞bEnd.3を使用し、膜貫通電気抵抗を測定します。

Abstract

血液脳関門(BBB)は、微小血管内皮細胞、星状細胞、および周皮細胞で構成される動的な生理学的構造です。BBBは、有害物質の輸送制限、栄養素の吸収、および脳内の代謝産物クリアランスの間の相互作用を調整することにより、中枢神経系の恒常性を維持するために不可欠です。BBBの in vitro モデルの構築は、神経疾患の病態生理学を探求し、薬理学的治療法を作成するための貴重なツールです。この研究では、bEnd.3細胞を24ウェルプレートの上部チャンバーに播種することにより、 in vitro 単層BBB細胞モデルを作成する手順について説明します。細胞バリア機能の完全性を評価するために、従来の上皮細胞電圧計を使用して、正常細胞とCoCl2誘導低酸素細胞の膜貫通電気抵抗をリアルタイムで記録しました。以上の実験は、BBBの in vitro モデルや中枢神経系疾患の治療薬の創製に有効なアイデアを提供することが期待されます。

Introduction

BBBは、血管内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、ニューロン、その他の細胞構造で構成される血液循環と神経組織の間のユニークな生物学的インターフェースです1。血液と脳の間のイオン、化学物質、細胞の流れは、このバリアによって厳密に制御されています。このホメオスタシスは、毒素や病原体から神経組織を保護すると同時に、脳の神経の適切な操作を可能にします2,3。BBBの完全性を維持することで、神経機能障害、浮腫、神経炎症など、中枢神経系に影響を与える疾患の発症と進行を効果的に防ぐことができます4。しかし、BBBのユニークな生理学的特性により、低分子医薬品の98%以上、高分子医薬品の100%が中枢神経系に入るのを防ぎます5。したがって、中枢神経系の薬剤の開発中にBBBを介した薬剤の浸透性を高めることは、治療効果を達成するために不可欠です6,7。基質のコンピューターシミュレーションスクリーニングにより、医薬品候補がBBBを通過する確率が大幅に向上しましたが、科学研究のニーズを満たすためには、信頼性が高く手頃な価格のin vitro/in vivo BBBモデルが依然として必要です8。

ハイスループット薬物スクリーニングのための迅速で手頃な技術は、in vitroモデル9です。医薬品がBBB機能に及ぼす影響の基本的なプロセスと、疾患の発症と進行における医薬品の役割を明らかにするために、一連の簡略化されたin vitro BBBモデルが作成されました。現在、一般的なin vitro BBBモデルは、血管内皮細胞とアストロサイト、ペリサイト、またはミクログリアによって構築される単層、共培養、動的、およびマイクロ流体モデル10,11,12である13,14。3D細胞培養はBBB15の生理学的構造とほぼ一致していますが、BBBの薬物スクリーニングの手段としての応用は、その複雑なデザインと標準以下の再現性によって依然として制約されています。対照的に、単分子膜in vitroモデルは、BBBの研究に最も頻繁に使用されるモデルであり、特定の細胞における膜トランスポーターおよびタイトジャンクションタンパク質の発現を決定するために適用できます。

膜貫通電気抵抗(TEER)測定は、抵抗を横切る細胞層を評価および監視し、バリアの細胞の完全性と透過性を評価する技術です。単分子膜の両側にある増殖培地または緩衝液に2つの電極を同時に挿入することにより、セルのコンパクト層16,17を通る交流または電気インピーダンスを測定することができる。in vitro BBBモデルが適切に作成されているかどうかを判断するために、TEERの測定は通常、ゴールドスタンダード18として採用されます。一方、BBB透過性に対する薬物作用の傾向は、薬物関与後の細胞層の電気抵抗の変化を測定することによって正確に予測することができる19。例えば、Fengらは、カタルポール(レフマニアエの主要な活性モノマー)が、BBBのタイトジャンクションタンパク質のリポ多糖誘導性ダウンレギュレーションを効果的に逆転させ、マウス脳内皮細胞層のTEER値を上昇させることができることを発見しました20。

神経炎症反応は、通常、BBBホメオスタシスの不均衡の主な原因である21。神経炎症性損傷を誘発する低酸素治療は、血液脳関門を破壊する主な方法であり、主に物理的方法と化学試薬法が含まれます。前者は、主に3ガスインキュベーターを利用して、細胞増殖環境中の酸素含有量を変化させて低酸素状態をシミュレートし22、後者は、CoCl2などのデオキシ試薬を細胞培養培地に人工的に導入することによって達成される23。ヘム中のCo2+がFe2+に置換されている場合、細胞は脱酸素状態のままになります。触媒基でFe2+がCo2+に置換されると、プロリンヒドロキシラーゼとアスパラギン酸ヒドロキシラーゼ活性が阻害され、低酸素誘導因子-1α(HIF-1α)が蓄積する24。持続的な低酸素状態では、細胞質におけるHIF-1αの脱リン酸化が細胞死を引き起こし、血管内皮増殖因子を活性化し、最終的に血管透過性を高めます。以前の研究25,26では、低酸素症が内皮タイトジャンクションタンパク質の発現を大幅に低下させてBBBの透過性を高めることが十分に実証されています。本研究では、24ウェルプレートに播種したbEnd.3細胞の時間抵抗曲線を測定し、簡単なBBBモデルを作成しました。このモデルを用いて、CoCl2介入後の細胞TEERの変化を特徴づけ、BBB保護のための薬物のスクリーニングに使用できる細胞モデルを構築しました。

Protocol

注:マウス脳由来内皮細胞.3(bEnd.3)を24ウェルプレートのチャンバーに接種し、特定の培地条件下でBBBの単純な in vitro モデルを構築しました。正常細胞と低酸素細胞のTEERをTEERメーターで測定しました(図1 、 図2)。 1. 溶液調製 FBS(10%、v/v)、100 U/mLペニシリン、および10 mg/mLストレプトマイシンを含むDMEM?…

Representative Results

このプロトコルにより、経内皮抵抗計に設定されたパラメータに従って、細胞の抵抗値の変化を記録することができました。異なる濃度のCoCl2で処理したbEnd.3細胞(生細胞数)の生存率をCCK-8アッセイでスクリーニングしました。CoCl2 によって引き起こされる細胞損傷が大きいほど、細胞生存率が低くなることが示されました。300 μMのCoCl2がin vitroで有意に細胞傷?…

Discussion

最も発達した身体器官の1つである脳は、記憶、認知、聴覚、嗅覚、運動など、さまざまな複雑な生理学的プロセスを制御しています27。脳は、人体で最も複雑で病気の器官の1つであると同時に、人体で最も複雑で病気の器官の1つです。多くの中枢神経系疾患の発生は、大気汚染、不規則な食事パターン、およびその他の要因を含む要因により、年々増加傾向を示していま?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

中国国家自然科学基金会(82274207および82104533)、寧夏回族自治区重点研究開発プログラム(2023BEG02012)、成都中華大学興林奨学生研究促進プロジェクト(XKTD2022013)からの財政的支援に感謝します。

Materials

24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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References

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Keywords: Blood-brain BarrierBBB ModelBEnd.3 CellsTransendothelial Electrical Resistance (TEER)Barrier IntegrityCell PermeabilityIn Vitro ModelCentral Nervous SystemDrug ScreeningHypoxia
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Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).
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