JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Registrering af barrierefunktionel integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via transendotelial elektrisk modstandsdetektion

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65938
, , , , , , ,
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy,Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Denne protokol beskriver en pålidelig og effektiv in vitro-model af hjernens blodbarriere. Metoden anvender musecerebrale vaskulære endotelceller bEnd.3 og måler transmembran elektrisk modstand.

Abstract

Blod-hjerne-barrieren (BBB) er en dynamisk fysiologisk struktur sammensat af mikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Ved at koordinere samspillet mellem begrænset transit af skadelige stoffer, næringsstofabsorption og metabolitclearance i hjernen er BBB afgørende for at bevare centralnervesystemets homeostase. Opbygning af in vitro-modeller af BBB er et værdifuldt værktøj til at udforske patofysiologien af neurologiske lidelser og skabe farmakologiske behandlinger. Denne undersøgelse beskriver en procedure til oprettelse af en in vitro monolags BBB-cellemodel ved såning af bEnd.3-celler i det øverste kammer på en 24-brøndplade. For at vurdere integriteten af cellebarrierefunktionen blev det konventionelle epitelcellevoltmeter brugt til at registrere den transmembrane elektriske modstand af normale celler og CoCl 2-inducerede hypoxiske celler i realtid. Vi forventer, at ovenstående forsøg vil give effektive ideer til oprettelse af in vitro-modeller af BBB og lægemidler til behandling af lidelser i centralnervesystemet.

Introduction

BBB er en unik biologisk grænseflade mellem blodcirkulation og nervevæv, som består af vaskulære endotelceller, pericytter, astrocytter, neuroner og andre cellulære strukturer1. Strømmen af ioner, kemikalier og celler mellem blodet og hjernen er strengt reguleret af denne barriere. Denne homeostase beskytter nervevævet mod toksiner og patogener, samtidig med at det muliggør en passende funktion af hjernens nerver 2,3. Opretholdelse af BBB’s integritet kan effektivt forhindre udvikling og progression af lidelser, der påvirker centralnervesystemet, såsom neuronal dysfunktion, ødem og neuroinflammation4. BBB’s unikke fysiologiske egenskaber forhindrer imidlertid mere end 98% af lægemidler med små molekyler og 100% af makromolekylære lægemidler i at komme ind i centralnervesystemet5. Derfor er det vigtigt at øge penetrationen af medicin gennem BBB under udviklingen af lægemidler til centralnervesystemet for at opnå terapeutisk effekt 6,7. Selv om computersimuleringsscreening af substrater har øget sandsynligheden for, at lægemiddelkandidater krydser BBB, er der stadig behov for pålidelige og overkommelige in vitro/in vivo BBB-modeller for at imødekomme behovene inden for videnskabelig forskning8.

En hurtig og overkommelig teknik til high-throughput lægemiddelscreening er in vitro model9. For at belyse de grundlæggende processer for lægemidlers virkninger på BBB-funktionen og deres rolle i udviklingen og udviklingen af sygdom er der skabt en række forenklede in vitro BBB-modeller. På nuværende tidspunkt er de almindelige in vitro BBB-modeller monolags-, co-kultur-, dynamiske og mikrofluidiske modeller 10,11,12, konstrueret af vaskulære endotelceller og astrocytter, pericytter eller mikroglia13,14. Selvom 3D-cellekulturer er mere i overensstemmelse med den fysiologiske struktur af BBB15, er deres anvendelse som et middel til lægemiddelscreening for BBB stadig begrænset af deres indviklede design og subpar reproducerbarhed. I modsætning hertil er monolags in vitro-modellen den, der hyppigst anvendes til forskning i BBB og er anvendelig til bestemmelse af ekspressionen af membrantransportører og tætte forbindelsesproteiner i bestemte celler.

Måling af transmembran elektrisk modstand (TEER) er en teknik til evaluering og overvågning af cellelaget over modstanden og evaluering af barrierens celleintegritet og permeabilitet. Ved samtidig at indsætte to elektroder i vækstmediet eller bufferopløsningen på hver side af monolaget er det muligt at måle vekselstrømmen eller den elektriske impedans gennem cellens kompakte lag16,17. For at afgøre, om in vitro BBB-modellen er oprettet korrekt, vil målingen af TEER normalt blive anvendt som guldstandard18. På den anden side kan tendensen til medicinvirkning på BBB-permeabilitet forudsiges nøjagtigt ved at måle ændringen i cellelagets elektriske modstand efter lægemiddelinvolvering19. For eksempel opdagede Feng et al., at catalpol (den primære aktive monomer af rehmanniae) effektivt kunne vende den lipopolysaccharid-inducerede nedregulering af tight junction-proteiner i BBB og hæve TEER-værdien af musehjernens endotelcellelag20.

Det neuroinflammatoriske respons er normalt hovedårsagen til BBB homeostase ubalance21. Hypoxisk behandling for at fremkalde neuroinflammatorisk skade er den vigtigste metode til at ødelægge blod-hjerne-barrieren, hovedsageligt inklusive fysiske metoder og kemiske reagensmetoder. Førstnævnte anvender primært en tre-gas-inkubator til at variere iltindholdet i cellevækstmiljøet for at simulere hypoxiske forhold22, mens sidstnævnte opnås ved kunstigt at indføre deoxyreagenser såsom CoCl2til cellekulturmediet23. Cellerne forbliver i en deoxygeneret tilstand, hvis Fe2 + erstattes af Co2 + i hæmmen. Hvis Fe2+ erstattes af Co2+ i den katalytiske gruppe, hæmmes prolinhydroxylase og aspartathydroxylaseaktivitet, hvilket resulterer i en akkumulering af hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α)24. Under vedvarende hypoxi udløser dephosphoryleringen af HIF-1α i cytoplasma celledød og aktiverer vaskulær endotelvækstfaktor, hvilket i sidste ende øger vaskulær permeabilitet. I tidligere undersøgelser 25,26 er det blevet godt demonstreret, at hypoxi signifikant kan reducere ekspressionen af endoteltætte forbindelsesproteiner for at øge permeabiliteten af BBB. I denne undersøgelse blev tidsmodstandskurven for bEnd.3-celler podet i plader med 24 brønde målt for at skabe en ligetil BBB-model. Ved hjælp af denne model karakteriserede vi ændringerne i celle TEER efter CoCl2-intervention for at konstruere en cellemodel, der kan bruges til at screene lægemidler til BBB-beskyttelse.

Protocol

BEMÆRK: Musehjerneafledte endotelceller.3 (bEnd.3) blev podet ind i kamrene på en 24-brønds plade for at konstruere en simpel in vitro-model af BBB under specifikke mediumbetingelser. TEER for normale celler og hypoxiske celler blev målt med TEER-meter (figur 1 og figur 2). 1. Forberedelse af opløsning Forbered DMEM-cellekulturmediet indeholdende FBS (10%, v / v), 100 E / ml penicillin og 10 mg…

Representative Results

Denne protokol tillod registrering af ændringer i cellernes modstandsværdier i henhold til parametrene indstillet i transendotelmodstandsmåleren. Levedygtigheden af bEnd.3-celler (antal levende celler) behandlet med forskellige koncentrationer afCoCl2 blev screenet ved CCK-8-assay. Større celleskader produceret afCoCl2 var repræsenteret ved lavere cellelevedygtighed. Vi fandt, at 300 μMCoCl2 var signifikant cytotoksisk in vitro, og denne koncentration blev anvendt til de n?…

Discussion

Et af de mest udviklede kropsorganer, hjernen styrer en bred vifte af indviklede fysiologiske processer, herunder hukommelse, kognition, hørelse, lugt og bevægelse27. Hjernen er et af menneskekroppens mest komplicerede og syge organer på samme tid. Forekomsten af mange lidelser i centralnervesystemet viser en stigende tendens år efter år på grund af faktorer, herunder luftforurening, uregelmæssige spisemønstre og andre faktorer 27,28,29.…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi sætter pris på den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (82274207 og 82104533), Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) og Xinglin Scholar Research Promotion Project fra Chengdu University of TCM (XKTD2022013).

Materials

24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Tags

Keywords: Blood-brain BarrierBBB ModelBEnd.3 CellsTransendothelial Electrical Resistance (TEER)Barrier IntegrityCell PermeabilityIn Vitro ModelCentral Nervous SystemDrug ScreeningHypoxia
check_url/kr/65938?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image