ヒト多能性幹細胞からの腸管神経系系統の分化
Summary
ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腸神経系(ENS)系統を導出することで、ENSの発生と疾患を研究し、再生医療で使用するためのスケーラブルな細胞源を提供します。ここでは、化学的に定義された培養条件を使用してhPSCから腸管ニューロンを誘導するための詳細な in vitro プロトコルを示します。
Abstract
ヒトの腸管神経系ENSは、神経伝達物質の多様性が顕著なグリア細胞とニューロン細胞の大規模なネットワークです。ENSは、腸の運動性、酵素分泌、栄養素の吸収を制御し、免疫系や腸内細菌叢と相互作用します。その結果、ENSの発達および後天性の欠陥は、多くのヒトの病気の原因であり、パーキンソン病の症状に寄与する可能性があります。動物モデルシステムにおける制限と初代組織へのアクセスは、ヒトENSの研究において大きな実験的課題を提起しています。ここでは、定義された培養条件を使用して、ヒト多能性幹細胞であるhPSCからENS系統を効果的にin vitro で誘導するための詳細なプロトコルを示します。私たちのプロトコルは、15日以内にhPSCを腸管神経堤細胞に特異的に分化することから始まり、30日以内に機能的な腸管ニューロンの多様なサブタイプを生み出します。このプラットフォームは、開発研究、疾患モデリング、創薬、再生アプリケーションのためのスケーラブルなリソースを提供します。
Introduction
腸管神経系(ENS)は、末梢神経系の最大の構成要素です。ENSには、消化管内に位置し、腸のほぼすべての機能を制御する4億個以上のニューロンが含まれています1。ENSの発生と機能、および腸管性ニューロパチーにおけるその欠陥の分子的理解には、腸管ニューロンの信頼できる本物の供給源へのアクセスが必要です。ヒトの初代組織へのアクセスは限られており、動物モデルは多くの腸内ニューロパチーの主要な疾患表現型を再現できていません。ヒト多能性幹細胞(hPSC)技術は、特に一次供給源2,3,4,5,6,7から単離が困難な細胞種を無制限に供給する上で非常に有益であることが証明されています。ここでは、hPSCからENS培養物を得るための段階的かつ堅牢なin vitro法について詳しく説明します。これらのスケーラブルなhPSC由来培養物は、発生研究、疾患モデリング、ハイスループット薬物スクリーニングへの道を開き、再生医療のための移植可能な細胞を提供することができます。
腸管ニューロン系統は、胚形成中のENS発生経路をたどる神経堤(NC)細胞に由来します。胚では、NC細胞は折り畳み式の神経板の縁に沿って出現します。それらは増殖し、移動し、感覚ニューロン、シュワン細胞、メラノサイト、頭蓋顔面骨格、腸内ニューロン、グリア8,9,10など、さまざまな細胞タイプを生じさせます。細胞の運命決定は、NC細胞が出現する前後軸に沿った明確な領域、すなわち、頭蓋NC、迷走神経NC、体幹NCおよび仙骨NCに依存する。ENSは迷走神経および仙骨のNC細胞から発生し、前者は腸の長さに沿って広範囲に移動し、腸にコロニーを形成するため、腸内ニューロンの集団を支配します11。
PSCからのNC細胞の誘導には、一般に、デュアルSMAD阻害とWNT経路活性化の組み合わせが含まれます12,13。最近まで、すべてのNC誘導プロトコルには、培養条件に血清やその他の動物製品添加物が含まれていました。化学的に未定義の媒体は、NC誘導の再現性を低下させるだけでなく、機構的な発生研究にも課題をもたらします。これらの課題を克服するために、Barberら14は、化学的に定義された培養条件を用いたNC誘導プロトコルを開発し、したがって、血清置換因子(例えば、KSR)13,14に依存する代替方法よりも有利であった。これは、基礎培地の置換と、hPSCから腸管NC細胞を誘導するためにFattahiらによって最初に提示されたプロトコルの最適化によって得られました。この改良されたシステムは、ここで紹介するhPSC分化プロトコルの基礎です。これは、レチノイン酸(RA)に加えてBMP、FGF、WNT、TGFβシグナル伝達の正確な調節により、15日間で腸管神経堤(ENC)細胞を誘導することから始まります。次に、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)で細胞を処理することにより、ENS系統を導き出します。すべての培地組成物は化学的に定義されており、30〜40日以内に堅牢な腸内ニューロン培養物が得られます。
ここで述べた単層細胞培養系に加えて、自由浮遊胚様体15,16を用いた代替のNC誘導法が開発されている。これらの培養物中の遊走性細胞は、迷走神経NCを表すサブセットでNCマーカーを発現することが示されています。初代腸組織との共培養は、これらの培養物の腸内NC前駆体を濃縮するために使用されてきました。これらの研究における培地組成物には、神経成長因子、NT3、脳由来神経栄養因子などのさまざまな因子の組み合わせが含まれています。この段階では、これらの要因が腸内ニューロン前駆体のコミットメントのアイデンティティにどのように影響するかは完全には明らかではありません。単分子膜と胚様体ベースの培養における腸内NC誘導を効率的に比較するには、より多くのデータが必要です。これらの戦略ではカルチャのレイアウトが異なるため、各方法の使用を検討し、特定のアプリケーションを念頭に置いて最適化する必要があります。
ここで提示されたプロトコルは再現性があり、異なるhPSC(誘導および胚)系統8,14,16を用いて、我々および他の者によって成功裏に試験されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで述べる分化プロトコルは、30〜40日以内にhPSCから腸管ニューロンを得るための頑健なin vitro法(図1E)と、古い培養物でグリア線維性酸性タンパク質、GFAP、およびSOX10を発現する腸グリアを得るための堅牢なインビトロ法を提供する(>55日目)13,14,19,22。これらのニュ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、UCSF Program for Breakthrough Biomedical ResearchおよびSandler Foundationからの助成金、March of Dimes助成金番号1-FY18-394および1DP2NS116769-01、NIHディレクターズニューイノベーター賞(DP2NS116769)からF.F.および国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(R01DK121169)からF.F.に支援されました。 NIH T32-DK007418フェローシップおよびUCSF画期的な生物医学研究のためのプログラム独立したポスドクフェローシップ。
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
References
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
- Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
- Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
- Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
- Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
- Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
- Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
- Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).
