Дифференцировка линий энтеральной нервной системы из плюрипотентных стволовых клеток человека
Summary
Получение линий энтеральной нервной системы (ЭНС) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) обеспечивает масштабируемый источник клеток для изучения развития и заболеваний ЭНС, а также для использования в регенеративной медицине. Здесь представлен подробный протокол in vitro для получения кишечных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования.
Abstract
Энтеральная нервная система человека, ЭНС, представляет собой обширную сеть глиальных и нейрональных клеток с замечательным разнообразием нейротрансмиттеров. ЭНС контролирует перистальтику кишечника, секрецию ферментов и усвоение питательных веществ, а также взаимодействует с иммунной системой и микробиомом кишечника. Следовательно, дефекты развития и приобретенные дефекты ЭНС ответственны за многие заболевания человека и могут способствовать появлению симптомов болезни Паркинсона. Ограничения в животных модельных системах и доступ к первичным тканям создают значительные экспериментальные проблемы в исследованиях ЭНС человека. Здесь представлен подробный протокол эффективного in vitro получения линий ENS из плюрипотентных стволовых клеток человека, hPSC, с использованием определенных условий культивирования. Наш протокол начинается с направленной дифференцировки hPSCs в клетки кишечного нервного гребня в течение 15 дней и позволяет получить различные подтипы функциональных кишечных нейронов в течение 30 дней. Эта платформа предоставляет масштабируемый ресурс для исследований в области развития, моделирования заболеваний, разработки лекарств и регенеративных приложений.
Introduction
Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении неограниченного источника желаемых типов клеток, особенно тех, которые трудно выделить из первичных источников 2,3,4,5,6,7. Здесь мы подробно описываем поэтапный и надежный метод in vitro для получения культур ЭНС из ЧПСК. Эти масштабируемые культуры, полученные из hPSC, открывают возможности для исследований развития, моделирования заболеваний и высокопроизводительного скрининга лекарств и могут обеспечить трансплантируемые клетки для регенеративной медицины.
Линии кишечных нейронов происходят от клеток нервного гребня (НК), следующих по пути развития ЭНС во время эмбриогенеза. У эмбрионов NC-клетки появляются по краям складчатой нервной пластинки. Они размножаются, мигрируют и дают начало множеству различных типов клеток, включая сенсорные нейроны, шванновские клетки, меланоциты, черепно-лицевой скелет и энтеральные нейроны, а также глии 8,9,10. Решение о судьбе клетки зависит от отдельной области вдоль передне-задней оси, из которой выходят НК-клетки, т.е. краниальной НК, НК блуждающего нерва, НК туловища и НК крестца. ЭНС развивается из вагусных и сакральных НК-клеток, причем первые доминируют в популяции кишечных нейронов из-за обширной миграции по длине кишечника и колонизации кишечника11.
Получение НК-клеток из ПСК обычно включает комбинацию двойного ингибирования SMAD и активации пути WNT12,13. До недавнего времени все протоколы индукции НЗ включали добавление сыворотки и других добавок продуктов животного происхождения в условия культивирования. Химически неопределенные среды не только снижают воспроизводимость индукции ЧПУ, но и затрудняют механистические исследования развития. Чтобы преодолеть эти проблемы, Barber etal. 14 разработали протокол индукции NC с использованием химически определенных условий культивирования и, следовательно, имел преимущество по сравнению с альтернативными методами, которые полагаются на факторы замещения сыворотки (например, KSR)13,14. Это было получено путем замещения базальных сред и оптимизации протокола, первоначально представленного Fattahi et al. для получения кишечных НК из hPSCs. Эта усовершенствованная система является основой представленного здесь протокола дифференцировки hPSC. Он начинается с индукции клеток кишечного нервного гребня (ENC) в течение 15-дневного периода путем точной модуляции сигналов BMP, FGF, WNT и TGFβ в дополнение к ретиноевой кислоте (RA). Затем мы получаем линии ЭНС путем обработки клеток нейротрофическим фактором глиальных клеток (GDNF). Все композиции сред определяются химически и дают устойчивые культуры кишечных нейронов в течение 30-40 дней.
В дополнение к описанной здесь монослойной системе культивирования клеток были разработаны альтернативные подходы к индукции НК, в которых используются свободно плавающие эмбриоидные тельца15,16. Было показано, что мигрирующие клетки в этих культурах экспрессируют маркеры NC с субпопуляцией, представляющей НК блуждающего нерва. Кокультуры с первичной тканью кишечника были использованы для обогащения кишечных предшественников НК в этих культурах. Медиа-композиции в этих исследованиях содержат комбинацию различных факторов, таких как фактор роста нервов, NT3 и нейротрофический фактор мозга. На данном этапе не совсем ясно, как эти факторы могут повлиять на идентичность предшественников энтеральных нейронов. Для эффективного сравнения индукции энтерального НК в монослое и культурах, основанных на эмбриоидном теле, требуется больше данных. Учитывая различия в расположении культур в этих стратегиях, использование каждого метода должно быть рассмотрено и оптимизировано в соответствии с конкретным приложением.
Представленный здесь протокол является воспроизводимым и был успешно протестирован нами и другими специалистами с использованиемразличных линий hPSC (индуцированных и эмбриональных) 8,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол дифференцировки обеспечивает надежный метод in vitro для получения энтеральных нейронов из hPSCs в течение 30-40 дней (рис. 1E) и кишечной глии, экспрессирующей глиальный фибриллярный кислый белок, GFAP и SOX10 в более старых культурах (> день 55)13,14,19,22.<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана грантами от Программы прорывных биомедицинских исследований UCSF и Фонда Сандлера, грантом March of Dimes No 1-FY18-394 и 1DP2NS116769-01, премией директора NIH New Innovator Award (DP2NS116769) для F.F. и Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (R01DK121169) для F.F., H.M. поддерживается стипендией Фонда Ларри Л. Хиллблома для постдокторантов. Стипендия NIH T32-DK007418 и независимая постдокторская стипендия UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
References
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
- Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
- Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
- Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
- Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
- Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
- Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
- Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).
