Generering af neurale nethinden fra menneskelige pluripotente stamceller
Summary
Denne protokol beskriver et optimeret 3D neuralt retina induktionssystem, der reducerer vedhæftning og fusion af retinale organoider med høj repeterbarhed og effektivitet.
Abstract
Retinopati er en af hovedårsagerne til blindhed på verdensplan. Undersøgelse af dets patogenese er afgørende for tidlig diagnose og rettidig behandling af retinopati. Desværre hindrer etiske barrierer indsamling af beviser fra mennesker. For nylig har adskillige undersøgelser vist, at humane pluripotente stamceller (PSC’er) kan differentieres til retinale organoider (RO’er) ved hjælp af forskellige induktionsprotokoller, som har et enormt potentiale inden for retinopati til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og stamcellebaserede terapier. Denne undersøgelse beskriver en optimeret induktionsprotokol til generering af neural nethinden (NR), der signifikant reducerer sandsynligheden for vesikulation og fusion, hvilket øger succesraten for produktionen indtil dag 60. Baseret på PSC’ernes evne til selvorganisering efter dissociation kombineret med visse komplementære faktorer kan denne nye metode specifikt drive NR-differentiering. Desuden er tilgangen ukompliceret, omkostningseffektiv, udviser bemærkelsesværdig repeterbarhed og effektivitet, præsenterer opmuntrende udsigter til personaliserede modeller af nethindesygdomme og leverer et rigeligt cellereservoir til applikationer som celleterapi, lægemiddelscreening og genterapitestning.
Introduction
Øjet fungerer som den primære informationskilde blandt menneskelige sanseorganer, hvor nethinden er det vigtigste visuelle sensoriske væv i pattedyrs øjne1. Retinopati står som en af de primære globale årsager til øjensygdomme, hvilket fører til blindhed2. Omkring 2,85 millioner mennesker verden over lider af varierende grader af synsnedsættelse på grund af retinopati3. Derfor er undersøgelse af dets patogenese afgørende for tidlig diagnose og rettidig behandling. De fleste undersøgelser af human retinopati har primært fokuseret på dyremodeller 4,5,6. Den menneskelige nethinde er imidlertid et komplekst, flerlags væv, der omfatter forskellige celletyper. Traditionelle todimensionelle (2D) cellekultur- og dyremodelsystemer undlader typisk trofast at rekapitulere den normale rumlige tidsmæssige udvikling og lægemiddelmetabolisme af den indfødte menneskelige nethinde 7,8.
For nylig har 3D-kulturteknikker udviklet sig til at generere vævslignende organer fra pluripotente stamceller (PSC’er)9,10. Retinale organoider (RO’er) genereret fra humane PSC’er i et 3D-suspensionskultursystem indeholder ikke kun syv retinale celletyper, men udviser også en tydelig stratificeret struktur svarende til den menneskelige nethinden in vivo 11,12,13. Humane PSC-afledte RO’er har vundet popularitet og udbredt tilgængelighed og er i øjeblikket de bedste in vitro-modeller til undersøgelse af udviklingen og sygdommen i den menneskelige nethinde14,15. I løbet af de sidste par årtier har adskillige forskere vist, at humane PSC’er, herunder embryonale stamceller (ESC’er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er), kan differentiere sig til RO’er ved hjælp af forskellige induktionsprotokoller. Disse fremskridt har et enormt potentiale inden for retinopati til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og stamcellebaserede terapier 16,17,18.
Imidlertid er genereringen af neurale nethinden (NR) fra humane pluripotente stamceller (PSC’er) en kompleks, besværlig og tidskrævende proces. Desuden kan batch-til-batch-variationer i vævsorganoider føre til lavere reproducerbarhed af resultater 19,20. Talrige iboende og ydre faktorer kan påvirke udbyttet af retinale organoider (RO’er), såsom antallet eller arten af startceller og brugen af transkriptionsfaktorer og småmolekyleforbindelser 21,22,23. Siden den første humane RO blev genereret af Sasai-laboratoriet11, er der gennem årene blevet foreslået flere ændringer for at forbedre letheden og effektiviteten af induktionsprocessen 13,21,24,25. Desværre er der til dato ikke etableret nogen guldstandardprotokol til generering af RO’er i alle laboratorier. Der er faktisk en vis grad af uoverensstemmelse i RO’er som følge af forskellige induktionsmetoder samt stor variation i ekspressionen af retinale markører og robustheden af deres struktur22,26. Disse problemer kan i alvorlig grad komplicere prøveindsamlingen og fortolkningen af undersøgelsesresultaterne. Derfor er der behov for en mere konsolideret og robust differentieringsprotokol for at maksimere effektiviteten med minimal heterogenitet af RO-generering.
Denne undersøgelse beskriver en optimeret induktionsprotokol baseret på en kombination af Kuwahara et al.12 og Döpper et al.27 med detaljerede instruktioner. Den nye metode reducerer signifikant sandsynligheden for organoid vesikulation og fusion, hvilket øger succesraten for generering af NR. Denne udvikling har et stort løfte om sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og celleterapiapplikationer til nethindesygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menneskelige RO’er kan rumligt og tidsmæssigt rekapitulere udviklingen af fosternethinden, og tidlige RO’er udviser en høj grad af lighed med fostrets nethinde på tilsvarende udviklingsstadier15. Med hensyn til vævsmorfologi og molekylær ekspression afspejler human RO nøje den faktiske vækststatus for nethindevævet, hvilket giver enorme og hidtil usete muligheder inden for sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og regenerativ medicin. I øjeblikket er der etableret flere forskellige meto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
