Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l’adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.
Abstract
La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l’approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.
Introduction
L’occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali 4,5,6. Tuttavia, la retina umana è un tessuto complesso e multistrato che comprende vari tipi di cellule. I tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale (2D) e i sistemi di modelli animali in genere non riescono a ricapitolare fedelmente il normale sviluppo spazio-temporale e il metabolismo farmacologico della retina umana nativa 7,8.
Recentemente, le tecniche di coltura 3D si sono evolute per generare organi simili ai tessuti da cellule staminali pluripotenti (PSCs)9,10. Gli organoidi retinici (RO) generati da PSC umane in un sistema di coltura in sospensione 3D non solo contengono sette tipi di cellule retiniche, ma mostrano anche una struttura stratificata distinta simile alla retina umana in vivo 11,12,13. Gli RO umani derivati da PSC hanno guadagnato popolarità e ampia disponibilità e sono attualmente i migliori modelli in vitro per lo studio dello sviluppo e della malattia della retina umana14,15. Negli ultimi decenni, numerosi ricercatori hanno dimostrato che le PSC umane, comprese le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), possono differenziarsi in RO utilizzando vari protocolli di induzione. Questi progressi hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening farmacologico e le terapie basate sulle cellule staminali 16,17,18.
Tuttavia, la generazione di retina neurale (NR) da cellule staminali pluripotenti umane (PSC) è un processo complesso, ingombrante e dispendioso in termini di tempo. Inoltre, le variazioni da lotto a lotto negli organoidi tissutali possono portare a una minore riproducibilità dei risultati19,20. Numerosi fattori intrinseci ed estrinseci possono influenzare la resa degli organoidi retinici (RO), come il numero o la specie di cellule di partenza e l’uso di fattori di trascrizione e composti a piccole molecole 21,22,23. Da quando il primo RO umano è stato generato dal laboratorio Sasai11, nel corso degli anni sono state proposte molteplici modifiche per migliorare la facilità e l’efficacia del processo di induzione 13,21,24,25. Purtroppo, ad oggi, non è stato stabilito alcun protocollo gold standard per la generazione di RO in tutti i laboratori. In effetti, c’è un certo grado di discrepanza negli RO risultanti da diversi metodi di induzione, così come un’ampia variazione nell’espressione dei marcatori retinici e nella robustezza della loro struttura22,26. Questi problemi possono complicare gravemente la raccolta dei campioni e l’interpretazione dei risultati dello studio. Pertanto, è necessario un protocollo di differenziamento più consolidato e robusto per massimizzare l’efficienza con una minima eterogeneità di generazione di RO.
Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato basato su una combinazione di Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27 con istruzioni dettagliate. Il nuovo metodo riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione degli organoidi, aumentando il tasso di successo della generazione di NR. Questo sviluppo è molto promettente per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le applicazioni di terapia cellulare per i disturbi della retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l’RO umana rispecchia da vicino l’effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigener…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
