Gerando Retina Neural a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas
Summary
O presente protocolo descreve um sistema otimizado de indução de retina neural 3D que reduz a adesão e fusão de organoides da retina com alta repetibilidade e eficiência.
Abstract
A retinopatia é uma das principais causas de cegueira no mundo. A investigação de sua patogênese é essencial para o diagnóstico precoce e tratamento oportuno da retinopatia. Infelizmente, barreiras éticas dificultam a coleta de evidências de seres humanos. Recentemente, numerosos estudos têm mostrado que células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) podem ser diferenciadas em organoides da retina (ROs) usando diferentes protocolos de indução, que têm enorme potencial na retinopatia para modelagem de doenças, triagem de drogas e terapias baseadas em células-tronco. Este estudo descreve um protocolo de indução otimizado para gerar retina neural (NR) que reduz significativamente a probabilidade de vesiculação e fusão, aumentando a taxa de sucesso de produção até o 60º dia. Baseado na capacidade das LSPs de se auto-reorganizarem após a dissociação, combinada com certos fatores complementares, esse novo método pode direcionar especificamente a diferenciação da NR. Além disso, a abordagem é descomplicada, custo-efetiva, exibe repetibilidade e eficiência notáveis, apresenta perspectivas encorajadoras para modelos personalizados de doenças da retina e fornece um reservatório celular abundante para aplicações como terapia celular, triagem de drogas e testes de terapia gênica.
Introduction
O olho serve como fonte primária de informação entre os órgãos sensoriais humanos, sendo a retina o principal tecido sensorial visual dos olhos demamíferos1. A retinopatia destaca-se como uma das principais causas globais de doenças oculares, levando àcegueira2. Aproximadamente 2,85 milhões de pessoas no mundo sofrem de graus variados de comprometimento da visão devido à retinopatia3. Consequentemente, a investigação de sua patogênese é crucial para o diagnóstico precoce e tratamento oportuno. A maioria dos estudos sobre retinopatia humana tem se concentrado principalmente em modelos animais 4,5,6. No entanto, a retina humana é um tecido complexo e multicamadas, composto por vários tipos celulares. Os sistemas tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) e modelos animais tipicamente falham em recapitular fielmente o desenvolvimento espaço-temporal normal e o metabolismo de drogas da retina humana nativa 7,8.
Recentemente, técnicas de cultura 3D evoluíram para gerar órgãos semelhantes a tecidos a partir de células-tronco pluripotentes (CTPs)9,10. Os organoides (ROs) da retina gerados a partir de LSPs humanas em um sistema de cultura em suspensão 3D não apenas contêm sete tipos de células retinianas, mas também exibem uma estrutura estratificada distinta, semelhante à retina humana in vivo11,12,13. As ERs derivadas de LSP humanas têm ganhado popularidade e ampla disponibilidade e são atualmente os melhores modelos in vitro para o estudo do desenvolvimento e da doença da retina humana14,15. Ao longo das últimas décadas, numerosos pesquisadores demonstraram que as PSCs humanas, incluindo células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), podem se diferenciar em ROs usando vários protocolos de indução. Esses avanços têm enorme potencial na retinopatia para modelagem de doenças, rastreamento de drogas e terapias baseadas em células-tronco 16,17,18.
No entanto, a geração de retina neural (NR) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) é um processo complexo, complicado e demorado. Além disso, variações lote a lote nos organoides teciduais podem levar a menor reprodutibilidade dos resultados19,20. Inúmeros fatores intrínsecos e extrínsecos podem influenciar o rendimento dos organoides (ROs) da retina, como o número ou espécie de células iniciadoras e o uso de fatores de transcrição e compostos de moléculas pequenas 21,22,23. Desde que a primeira OR humana foi gerada pelo laboratório Sasai11, múltiplas modificações foram propostas ao longo dos anos para aumentar a facilidade e a eficácia do processo de indução 13,21,24,25. Infelizmente, até o momento, nenhum protocolo padrão-ouro foi estabelecido para a geração de ROs em todos os laboratórios. De fato, há certo grau de discrepância nas ER decorrentes dos diferentes métodos de indução, bem como grande variação na expressão dos marcadores retinianos e na robustez de sua estrutura22,26. Essas questões podem complicar gravemente a coleta de amostras e a interpretação dos achados do estudo. Portanto, um protocolo de diferenciação mais consolidado e robusto é necessário para maximizar a eficiência com o mínimo de heterogeneidade da geração de OR.
Este estudo descreve um protocolo de indução otimizado baseado na combinação de Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27 com instruções detalhadas. O novo método reduz significativamente a probabilidade de vesiculação e fusão organoide, aumentando a taxa de sucesso na geração de NR. Esse desenvolvimento é uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e aplicações de terapia celular para distúrbios da retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
As ERs humanas podem recapitular espacial e temporalmente o desenvolvimento da retina fetal, e as ERs precoces exibem alto grau de semelhança com a retina fetal em estágios equivalentes de desenvolvimento15. Em termos de morfologia tecidual e expressão molecular, a OR humana espelha de perto o estado de crescimento real do tecido da retina, fornecendo oportunidades tremendas e sem precedentes nos campos da modelagem de doenças, triagem de drogas e medicina regenerativa. Atualmente, vários mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
