वर्तमान प्रोटोकॉल एक अनुकूलित 3 डी तंत्रिका रेटिना प्रेरण प्रणाली का वर्णन करता है जो उच्च पुनरावृत्ति और दक्षता के साथ रेटिना ऑर्गेनोइड के आसंजन और संलयन को कम करता है।
रेटिनोपैथी दुनिया भर में अंधेपन के मुख्य कारणों में से एक है। रेटिनोपैथी के शीघ्र निदान और समय पर उपचार के लिए इसके रोगजनन की जांच करना आवश्यक है। दुर्भाग्य से, नैतिक बाधाएं मनुष्यों से साक्ष्य के संग्रह में बाधा डालती हैं। हाल ही में, कई अध्ययनों से पता चला है कि मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) को विभिन्न प्रेरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड (आरओ) में विभेदित किया जा सकता है, जिसमें रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और स्टेम सेल-आधारित उपचारों के लिए रेटिनोपैथी में भारी क्षमता होती है। यह अध्ययन तंत्रिका रेटिना उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है (एनआर) कि काफी vesiculation और संलयन की संभावना कम कर देता है, दिन तक उत्पादन की सफलता दर में वृद्धि 60. पृथक्करण के बाद पीएससी की आत्म-पुनर्गठन की क्षमता के आधार पर, कुछ पूरक कारकों के साथ संयुक्त, यह नई विधि विशेष रूप से एनआर भेदभाव को चला सकती है। इसके अलावा, दृष्टिकोण सरल, लागत प्रभावी है, उल्लेखनीय पुनरावृत्ति और दक्षता प्रदर्शित करता है, रेटिना रोगों के व्यक्तिगत मॉडल के लिए उत्साहजनक संभावनाएं प्रस्तुत करता है, और सेल थेरेपी, ड्रग स्क्रीनिंग और जीन थेरेपी परीक्षण जैसे अनुप्रयोगों के लिए भरपूर मात्रा में सेल जलाशय प्रदान करता है।
आंख मानव संवेदी अंगों के बीच जानकारी के प्राथमिक स्रोत के रूप में कार्य करती है, जिसमें रेटिना स्तनधारीआंखों में प्रमुख दृश्य संवेदी ऊतक है। रेटिनोपैथी नेत्र रोगों के प्राथमिक वैश्विक कारणों में से एक है, जिससे अंधापनहोता है। दुनिया भर में लगभग 2.85 मिलियन लोग रेटिनोपैथी के कारण दृष्टि हानि की अलग-अलग डिग्री से पीड़ितहैं। नतीजतन, प्रारंभिक निदान और समय पर उपचार के लिए इसके रोगजनन की जांच करना महत्वपूर्ण है। मानव रेटिनोपैथी पर अधिकांश अध्ययन मुख्य रूप से पशु मॉडल 4,5,6 पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, मानव रेटिना एक जटिल, बहुस्तरीय ऊतक है जिसमें विभिन्न कोशिका प्रकार शामिल हैं। पारंपरिक दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति और पशु मॉडल सिस्टम आम तौर पर ईमानदारी से सामान्य spatiotemporal विकास और देशी मानव रेटिना 7,8 की दवा चयापचय पुनरावृत्ति करने में विफल.
हाल ही में, 3 डी संस्कृति तकनीक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी)9,10से ऊतक जैसे अंगों को उत्पन्न करने के लिए विकसित हुई है। एक 3 डी निलंबन संस्कृति प्रणाली में मानव पीएससी से उत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड (आरओ) में न केवल सात रेटिना सेल प्रकार होते हैं, बल्कि विवो 11,12,13में मानव रेटिना के समान एक अलग स्तरीकृत संरचना भी प्रदर्शित करते हैं। मानव पीएससी व्युत्पन्न आरओ लोकप्रियता और व्यापक उपलब्धता हासिल की है और वर्तमान में विकास और मानव रेटिना 14,15 की बीमारी का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सबसे अच्छा कर रहे हैं. पिछले कुछ दशकों में, कई शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया है कि मानव पीएससी, भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) सहित, विभिन्न प्रेरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरओ में अंतर कर सकते हैं। इन प्रगति रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और स्टेम सेल आधारित चिकित्सा 16,17,18 के लिए रेटिनोपैथी में भारी क्षमता पकड़.
हालांकि, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) से तंत्रिका रेटिना (एनआर) की पीढ़ी एक जटिल, बोझिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है। इसके अलावा, ऊतक organoids में बैच से बैच बदलाव परिणाम19,20 की कम प्रजनन क्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. कई आंतरिक और बाह्य कारक रेटिना ऑर्गेनोइड (आरओ) की उपज को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि कोशिकाओं की संख्या या प्रजातियां और प्रतिलेखन कारकों और छोटे-अणु यौगिकों का उपयोग 21,22,23. चूंकि पहला मानव आरओ ससाई प्रयोगशाला11 द्वारा उत्पन्न किया गया था, इसलिए प्रेरण प्रक्रिया 13,21,24,25की आसानी और प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए वर्षों में कई संशोधनों का प्रस्ताव किया गया है। दुर्भाग्य से, आज तक, सभी प्रयोगशालाओं में आरओ उत्पन्न करने के लिए कोई स्वर्ण मानक प्रोटोकॉल स्थापित नहीं किया गया है। वास्तव में, विभिन्न प्रेरण विधियों के परिणामस्वरूप आरओ में विसंगति की एक निश्चित डिग्री है, साथ ही रेटिना मार्करों की अभिव्यक्ति में व्यापक भिन्नता औरउनकी संरचना 22,26 की मजबूती है। ये मुद्दे नमूना संग्रह और अध्ययन निष्कर्षों की व्याख्या को गंभीर रूप से जटिल कर सकते हैं। इसलिए, आरओ पीढ़ी की न्यूनतम विविधता के साथ दक्षता को अधिकतम करने के लिए एक अधिक समेकित और मजबूत भेदभाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।
यह अध्ययन विस्तृत निर्देशों के साथ कुवाहारा एट अल.12 और डॉपर एट अल.27 के संयोजन के आधार पर एक अनुकूलित प्रेरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। नई विधि ऑर्गेनॉइड वेसिक्यूलेशन और फ्यूजन की संभावना को काफी कम कर देती है, जिससे एनआर उत्पन्न करने की सफलता दर बढ़ जाती है। यह विकास रेटिना विकारों के लिए रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए बहुत अच्छा वादा करता है।
मानव आरओ स्थानिक और अस्थायी भ्रूण रेटिना के विकास recapituate कर सकते हैं, और जल्दी आरओ विकास15 के बराबर चरणों में भ्रूण रेटिना के लिए समानता का एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन. ऊतक आकृति विज्ञान और आणविक अभ…
The authors have nothing to disclose.
कोई नहीं।
0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
Taurine | Sigma | T0625-10G | |
Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |