Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant
Summary
Nous décrivons une méthode pour étudier comment le pH répond aux signaux environnementaux dans les glycosomes de la forme sanguine des trypanosomes africains. Cette approche implique une sonde de protéine héréditaire sensible au pH en combinaison avec la cytométrie en flux pour mesurer la dynamique du pH, à la fois en tant que test temporel et dans un format de criblage à haut débit.
Abstract
Le métabolisme du glucose est essentiel pour le trypanosome africain, Trypanosoma brucei, en tant que processus métabolique essentiel et régulateur du développement du parasite. On sait peu de choses sur les réponses cellulaires générées lorsque les niveaux de glucose environnementaux changent. Dans les parasites de la circulation sanguine et de la forme procyclique (stade d’insecte), les glycosomes abritent la majeure partie de la glycolyse. Ces organites sont rapidement acidifiés en réponse à la privation de glucose, ce qui entraîne probablement la régulation allostérique des enzymes glycolytiques telles que l’hexokinase. Dans les travaux précédents, la localisation de la sonde chimique utilisée pour effectuer les mesures de pH était difficile, ce qui limitait son utilité dans d’autres applications.
Cet article décrit le développement et l’utilisation de parasites qui expriment pHluorin2 localisée glycosomiquement, un biocapteur de pH protéique héréditaire. pHluorin2 est une variante ratiométrique de la pHluorin qui présente une diminution de l’excitation dépendante du pH (acide) à 395 nm tout en produisant simultanément une augmentation de l’excitation à 475 nm. Les parasites transgéniques ont été générés en clonant le cadre de lecture ouvert de pHluorin2 dans le vecteur d’expression du trypanosome pLEW100v5, permettant l’expression inductible de protéines à l’une ou l’autre étape du cycle de vie. L’immunofluorescence a été utilisée pour confirmer la localisation glycosomale du biocapteur pHluorin2, en comparant la localisation du biocapteur à la protéine résidente glycosomale aldolase. La réactivité de la sonde a été calibrée à différents niveaux de pH en incubant des cellules dans une série de tampons dont le pH variait de 4 à 8, une approche que nous avons déjà utilisée pour étalonner une sonde de pH à base de fluorescéine. Nous avons ensuite mesuré la fluorescence de pHluorin2 à 405 nm et 488 nm en utilisant la cytométrie en flux pour déterminer le pH glycosomal. Nous avons validé les performances des parasites transgéniques vivants exprimant pHluorin2, en surveillant le pH dans le temps en réponse à la privation de glucose, un déclencheur connu de l’acidification glycosomale chez les parasites PF. Cet outil a une gamme d’applications potentielles, y compris potentiellement utilisé dans le criblage de médicaments à haut débit. Au-delà du pH glycosomal, la sonde pourrait être adaptée à d’autres organites ou utilisée dans d’autres trypanosomatidés pour comprendre la dynamique du pH dans le cadre de cellules vivantes.
Introduction
Les kinétoplastides parasites, comme la plupart des organismes vivants, dépendent du glucose comme composant fondamental du métabolisme central du carbone. Ce groupe comprend des organismes médicalement importants, tels que le trypanosome africain, Trypanosoma brucei ; le trypanosome américain, T. cruzi ; et les parasites du genre Leishmania. Le métabolisme du glucose est essentiel à la croissance du parasite dans les stades du cycle de vie pathogène. Par exemple, lorsqu’il est privé de glucose, la forme sanguine (BSF) du trypanosome africain meurt rapidement. Notamment, la glycolyse est la seule source d’ATP à ce stade de l’infection1. Les parasites Leishmania dépendent également du glucose de l’hôte humain, le stade du cycle de vie de l’amastigote qui réside dans les macrophages de l’hôte dépendant de cette source de carbone pour sa croissance2.
Bien que ces parasites aient des modes de vie distincts impliquant différents insectes vecteurs, ils partagent de nombreux points communs dans la façon dont ils réagissent et consomment le glucose. Par exemple, ces parasites localisent la plupart des enzymes glycolytiques dans des peroxysomes modifiés appelés glycosomes. Cet organite spécifique au kinétoplastide est apparenté aux peroxysomes de mammifères sur la base de mécanismes de biosynthèse conservés et de morphologie 3,4,5,6.
La compartimentation de la plupart des enzymes de la voie glycolytique dans le glycosome offre des moyens spécifiques au parasite de réguler la voie. À l’aide d’une sonde de pH chimique, nous avons établi que la privation de nutriments déclenche une acidification rapide des glycosomes parasitaires de forme procyclique (PF) qui entraîne une altération de l’activité enzymatique glycolytique par exposition d’un site de liaison régulateur allostérique sur l’enzyme glycolytique clé hexokinase 7,8. Dans nos travaux précédents, la sonde chimique nécessitait une livraison constante pour être utilisée, ce qui limitait son utilité dans d’autres applications. De plus, les difficultés à maintenir la distribution de la sonde dans le glycosome dans le BSF ont limité l’utilité de l’approche pour étudier le pH glycosomal à ce stade de vie.
Dans cette étude, nous avons utilisé le biocapteur de protéines fluorescentes pHluorin2 pour surveiller le changement de pH glycosomal chez BSF T. brucei en réponse à des signaux environnementaux, y compris la privation de glucose9 (Figure 1). Les résultats de ce travail suggèrent que le FPS T. brucei acidifie rapidement les glycosomes en réponse à la famine de manière réversible, comme nous l’avons observé chez les parasites PF. Nous espérons que ce biocapteur améliorera notre compréhension de la régulation glycolytique chez T. brucei et les parasites apparentés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perception environnementale et les mécanismes de réponse du trypanosome africain sont mal compris. Les changements dans la disponibilité des nutriments sont connus pour déclencher diverses réponses chez le parasite, y compris l’acidification des glycosomes. Ici, nous avons décrit une méthode pour étudier la réponse du pH glycosomal aux perturbations environnementales dans les cellules vivantes à l’aide d’un capteur de protéines héréditaires, pHluorin2, et de la cytométrie en flux.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 a été cloné en pLEW100v5 par Twist Bioscience qui a fourni la construction dans un vecteur de clonage à haute copie ; pLEW100v5 était un cadeau du Dr George Cross. L’antisérum contre T. brucei aldolase est disponible sur demande auprès du Dr Meredith T. Morris, de l’Université de Clemson. Les travaux des laboratoires JCM et KAC ont été partiellement soutenus par un prix des National Institutes of Health (R01AI156382). Le SSP a été soutenu par le NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
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