Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo
Summary
Describimos un método para estudiar cómo responde el pH a las señales ambientales en los glicosomas del torrente sanguíneo de los tripanosomas africanos. Este enfoque implica un sensor de proteínas hereditarias sensible al pH en combinación con citometría de flujo para medir la dinámica del pH, tanto como un ensayo de curso temporal como en un formato de pantalla de alto rendimiento.
Abstract
El metabolismo de la glucosa es fundamental para el tripanosoma africano, Trypanosoma brucei, como un proceso metabólico esencial y regulador del desarrollo del parásito. Poco se sabe sobre las respuestas celulares que se generan cuando cambian los niveles ambientales de glucosa. Tanto en el torrente sanguíneo como en la forma procíclica (etapa de insecto), los glicosomas albergan la mayor parte de la glucólisis. Estos orgánulos se acidifican rápidamente en respuesta a la privación de glucosa, lo que probablemente resulta en la regulación alostérica de enzimas glucolíticas como la hexoquinasa. En trabajos anteriores, la localización de la sonda química utilizada para realizar mediciones de pH era un desafío, lo que limitaba su utilidad en otras aplicaciones.
En este trabajo se describe el desarrollo y uso de parásitos que expresan pHluorin2 localizada glucosómicamente, un biosensor de pH de proteína heredable. pHluorin2 es una variante radiométrica de pHluorin que muestra una disminución dependiente del pH (ácido) en la excitación a 395 nm mientras que simultáneamente produce un aumento en la excitación a 475 nm. Los parásitos transgénicos se generaron mediante la clonación del marco de lectura abierto de pHluorin2 en el vector de expresión de tripanosomas pLEW100v5, lo que permitió la expresión inducible de proteínas en cualquiera de las etapas del ciclo de vida. Se utilizó inmunofluorescencia para confirmar la localización glusómica del biosensor pHluorin2, comparando la localización del biosensor con la proteína residente glusómica aldolasa. La capacidad de respuesta del sensor se calibró a diferentes niveles de pH mediante la incubación de células en una serie de tampones que variaban en pH de 4 a 8, un enfoque que hemos utilizado previamente para calibrar un sensor de pH basado en fluoresceína. A continuación, medimos la fluorescencia de pHluorin2 a 405 nm y 488 nm mediante citometría de flujo para determinar el pH glusómico. Validamos el comportamiento de los parásitos transgénicos vivos que expresan pHluorin2, monitorizando el pH a lo largo del tiempo en respuesta a la privación de glucosa, un desencadenante conocido de la acidificación glusómica en parásitos PF. Esta herramienta tiene una serie de aplicaciones potenciales, incluida la posibilidad de ser utilizada en el cribado de drogas de alto rendimiento. Más allá del pH glusómico, el sensor podría adaptarse a otros orgánulos o usarse en otros tripanosomátidos para comprender la dinámica del pH en el entorno de células vivas.
Introduction
Los cinetoplástidos parásitos, como la mayoría de los organismos vivos, dependen de la glucosa como un componente fundamental del metabolismo central del carbono. Este grupo incluye organismos de importancia médica, como el tripanosoma africano, Trypanosoma brucei; el tripanosoma americano, T. cruzi; y parásitos del género Leishmania. El metabolismo de la glucosa es fundamental para el crecimiento del parásito en las etapas del ciclo de vida patógeno. Por ejemplo, cuando se le priva de glucosa, la forma del torrente sanguíneo (BSF) del tripanosoma africano muere rápidamente. En particular, la glucólisis sirve como la única fuente de ATP durante esta etapa de la infección1. Los parásitos de Leishmania también dependen de la glucosa en el huésped humano, y la etapa del ciclo de vida del amastigote que reside en los macrófagos del huésped depende de esta fuente de carbonopara su crecimiento.
Si bien estos parásitos tienen estilos de vida distintos que involucran diferentes insectos vectores, comparten muchos puntos en común en la forma en que responden y consumen glucosa. Por ejemplo, estos parásitos localizan la mayoría de las enzimas glucolíticas en peroxisomas modificados llamados glicosomas. Este orgánulo específico del cinetoplastido está relacionado con los peroxisomas de mamíferos en base a los mecanismos biosintéticos conservados y la morfología 3,4,5,6.
La compartimentación de la mayoría de las enzimas de la vía glucolítica en el glucosoma ofrece medios específicos para el parásito de regulación de la vía. Utilizando una sonda química de pH, establecimos que la privación de nutrientes desencadena una rápida acidificación de los glicosomas del parásito en forma procíclica (PF) que da lugar a una actividad enzimática glucolítica alterada a través de la exposición de un sitio de unión de un regulador alostérico en la enzima glucolítica clave hexoquinasa 7,8. En nuestro trabajo anterior, la sonda química requería una entrega constante para su uso, lo que limitaba su utilidad en otras aplicaciones. Además, los desafíos para mantener la distribución de la sonda en el glicosoma en el BSF limitaron la utilidad del enfoque para investigar el pH glusómico en esa etapa de la vida.
En este estudio, hemos utilizado el biosensor de proteína fluorescente pHluorin2 para monitorizar el cambio de pH glusómico en BSF T. brucei en respuesta a señales ambientales, incluida la inanición de glucosa9 (Figura 1). Los resultados de este trabajo sugieren que BSF T. brucei acidifica los glicosomas rápidamente en respuesta a la inanición de manera reversible, similar a las respuestas que hemos observado en los parásitos PF. Esperamos que este biosensor mejore nuestra comprensión de la regulación glucolítica en T. brucei y parásitos relacionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La percepción ambiental y los mecanismos de respuesta en el tripanosoma africano son poco conocidos. Se sabe que los cambios en la disponibilidad de nutrientes desencadenan diversas respuestas en el parásito, incluida la acidificación de los glicosomas. Aquí, hemos descrito un método para estudiar la respuesta del pH glusómico a las perturbaciones ambientales en células vivas utilizando un sensor de proteína heredable, pHluorin2, y citometría de flujo.
Hay varios pasos críticos en el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 fue clonado en pLEW100v5 por Twist Bioscience, que proporcionó la construcción en un vector de clonación de alta copia; pLEW100v5 fue un regalo del Dr. George Cross. El antisuero contra la aldolasa de T. brucei está disponible en la Dra. Meredith T. Morris, de la Universidad de Clemson, previa solicitud. El trabajo de los laboratorios JCM y KAC fue parcialmente apoyado por un premio de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI156382). SSP fue apoyado por NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
- Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
- Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
- Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
- Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
- Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. 생화학. 52 (21), 3629-3637 (2013).
- Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- . Restriction digest v.2 Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018)
- . Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021)
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
- Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
- Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. 유전학. 171 (2), 517-526 (2005).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
- Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
- Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
- Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
- Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
- Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).
